Простой Массовая считывания цифровых нуклеиновых кислот количественного определения Анализы
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
Цифровые анализы являются мощными методы, позволяющие обнаружение редких клеток и подсчета отдельных молекул нуклеиновых кислот. Тем не менее, цифровые анализы еще не применяется обычно, из-за стоимости и определенного оборудования, связанного с коммерчески доступных методов. Здесь мы представляем упрощенный метод для считывания цифровых анализов капель с использованием обычного ПЦР в реальном времени инструмент для измерения объемной флуоресценции капель на основе цифровых анализов.
Мы характеризуют производительность объемной считывания анализа с использованием синтетических смесей капель и капель цифрового усиления несколько смещение (МДА) анализа. Количественный MDA особенно выгоды от цифровом формате реакции, но наш новый метод применяется к любому цифровому анализа. Для установленных цифровых протоколов анализа, таких как цифровой ПЦР, этот метод служит для ускорения и упрощения анализа считывание.
Наша методология основная считывания приносит преимущества partitioneD анализы без необходимости специализированного считывания инструментовки. Основные ограничения методики объемной считывания уменьшается динамический диапазон по сравнению с капли подсчета платформ и необходимость стандартного образца, хотя требования к этому стандарту, менее требовательны, чем стандартном эксперименте в режиме реального времени. Количественный весь геном усиления (WGA) используется для проверки на наличие загрязнений в WGA реакций и является наиболее чувствительным способом обнаружения присутствия фрагментов ДНК с неизвестными последовательностями, давая метод большие надежды в различных прикладных областях, включая фармацевтического контроля качества и астробиологии.
Introduction
Цифровые анализы для количественного нуклеиновых кислот (ПЦР цифровой) 1-4 и основание порядка (последовательности) сильно влияют на науки о жизни и медицина. Цифровые анализы обеспечивают количественную молекулярных графов по абсолютной шкале (не по отношению к контролю), обеспечивая высокую чувствительность, что позволяет легкое сравнение по экспериментах, и самое главное, что позволяет строительство крупных баз данных, содержащих сопоставимые данные 5 (таблица 1).
За последние 15 лет, весь геном усиления (WGA) появились вместе ПЦР в качестве общего инструмента для амплификации нуклеиновых кислот. Как ПЦР, WGA является полезным для аналитических и препаративных применений путем амплификации минуту элементы дискретизации до уровня, который может быть легко обнаружен и используется для последующих анализов, таких как базовой последовательности. В отличие от ПЦР, WGA не является специфичным для конкретного локуса ДНК, а позволяет усиление всех последовательностей в образце, в том числе неизвестных последовательностей.Это фундаментальное различие между PCR и WGA делает методы дополняют друг друга и приводит к различным вызовам в их применении.
Высокий выход WGA реакций 6 позволяет рутинной амплификации геномной ДНК из отдельных молекул 7, 8 одиночных клеток и других образцов с низким биомассы 9 для количественного или дальнейшего анализа. Основные проблемы, связанные с WGA химии являются его крайняя чувствительность к загрязнению и неравномерное усиление по отдельным матричных молекул 6. Тем не менее, РГА набирает популярность в качестве одноклеточного последовательности возникла как "убийца применения" WGA технологии 10 и шаблона количественного определения WGA является важным во многих областях применения 7.
Инструменты для цифрового количественного нуклеиновых кислот было описано ранее в различных клапаном и бесклапанного микрожидкостных FORMATS 11-14, в том числе капель на основе анализов 15,16 (таблица 2). Тем не менее, коммерческие микрофлюидных системы цифрового анализа требует специального оборудования для установки реакции и обнаружения продукта 17. Пользовательские клапанных микрофлюидики являются гибкими, но требуют точности изготовления микроструктур и пневматические системы управления 18. В то время как это относительно просто сделать монодисперсных микро-капли для эмульсионных основе цифровых анализов 19,20, цифровой дисплей технически обременительным, требуя либо масштабную изображений широкого поля (аналогично популярных технологий секвенирования следующего поколения) 21,22 или высокоскоростной поток на основе обнаружения капель 23-25. В идеале, цифровой анализ было бы просто из набора к считывания, снижая потребность в комплексной аппаратуры и позволяет большое количество образцов, которые будут считывать быстро. Здесь мы опишем упрощенный способ считывания цифровых капель анализов, которые использует обычный ПЦР в реальном времени яnstrument для измерения объемной флуоресценции капель на основе цифровых анализов.
В то время как новый подход может быть применен к цифровым ПЦР, особенно предпочтительно для цифровых WGA анализов для какого аналогового реальном времени амплификации анализы (которые дают превосходные результаты для ПЦР) являются проблематичными. WGA обычно применяется к образцам с молекулами шаблона, которые неоднородны по последовательности, длины и базового содержания. Эти различные матричных молекул усиливаются с различными скоростями 6, что требует использования ссылки ("стандартный") образца с соответствующими характеристиками. Часто существует такой стандарт не доступен, или характеристик входящих выборок неизвестны. Неоднородность исходного материала и длины зависит от имущества WGA химических 26 также усложняет интерпретацию результатов путем создания двусмысленности в то, что количественно – входной массу, введите число молекул, сочетание двух, или ни одного. Fаконец, последовательность-неспецифичность оказывает усиление количественного несколько смещение (МДА) более чувствительны к загрязнению, чем количественной ПЦР, так как загрязняющие молекулы любой последовательности есть потенциал, чтобы вмешиваться. Микрофлюидных цифровые анализы обратиться загрязнения путем разделения молекул шаблона и снижения объемов реакции, такие, что меньше загрязняющие вещества пробы.
Здесь мы используем популярный метод изотермического WGA, MDA 27. Следует отметить, что несколько других химические WGA в том числе и PicoPlex MALBAC 28 в решающей степени зависеть от начальных этапов изотермический замещения цепи. Изотермические шаги усугубить проблему применения аналоговых реальном времени для количественного анализов РГА. WGA не может быть ни полностью предотвратить во время установки, что приводит к нежелательному переменной предварительной амплификации, ни дискретизированы ("циклическое") в пути, где репликации разнородных молекул может привести к их завершению и остановился до следующего цикла, как ПЦР 11 </suр> (рис 1). Цифровой формат анализа для WGA вмещает типичные процедуры настройки реакции из-за сегрегации каждой молекулы для перечисления на конечной анализа (так предварительной амплификации не влияет на результаты) оригинал считывания означает точность будет в значительной степени зависит от изменения эффективности амплификации.
Анализ зависит от капель, произведенных в масле с единых объемов, а уровень сигнала на капли на конечной анализа будет зависеть от объема капли, и мы не хотим, чтобы консистенция результатов зависит от усреднения по распределению размеров капель. Создание монодисперсных капель теперь стандартная процедура (около 3500 Монодисперсные капель документы были опубликованы с 2013 года), но требует микрожидкостных приборы 25. На самом деле, больше, чем шесть компаний разработали независимые коммерческие продукты, которые полагаются на производство таких капель, и капли решений микрофлюидных чипыв продаже 23,29. Для этого исследования мы использовали пользовательские устройства, произведенные микрожидкостных в доме (см Protocol). Шприцевые насосы для привода потока через устройства также коммерчески доступны, но в качестве альтернативы, может быть замещен одной одноразового шприца вакуумного приводом потока снизить затраты 30.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цифровые анализы являются мощными методы, позволяющие обнаружение редких клеток и подсчета индивидуума молекул нуклеиновой кислоты. Тем не менее, цифровые анализы еще не применяется обычно в аналитических лабораториях, отчасти из-за стоимости специализированного оборудования, связ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
Riferimenti
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O’Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- . Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip.. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. . Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- Hindson, B. J. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
