Articolo metodologico

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

DOI:

10.3791/52925

⸱

24 settembre 2015

 , 
1Broad Institute, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura semplificata (analogica). Misuriamo la fluorescenza di massa di saggi digitali basati su goccioline utilizzando una macchina qPCR standard piuttosto che una strumentazione specializzata e confermiamo i nostri risultati mediante microscopia.

Abstract

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Saggi digitali sono potenti metodi che permettono il rilevamento di cellule rare e il conteggio delle singole molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali sono ancora abitualmente applicata, a causa del costo e attrezzature specifiche associati ai metodi disponibili in commercio. Qui vi presentiamo un metodo semplificato per la lettura di saggi gocciolina digitali utilizzando uno strumento di PCR in tempo reale convenzionale per misurare la fluorescenza massa di saggi digitali basate goccioline-.

Abbiamo caratterizzare le prestazioni del test lettura bulk utilizzando miscele gocciolina sintetici e digitale dosaggio gocciolina multiple displacement amplification (MDA). Quantitative MDA particolare beneficia di un formato di reazione digitale, ma il nostro nuovo metodo si applica a qualsiasi dosaggio digitale. Per i protocolli di analisi digitali affermati come la PCR digitale, questo metodo serve ad accelerare e semplificare test di lettura.

La nostra metodologia di massa lettura porta i vantaggi di partitionesaggi d senza la necessità di strumentazione lettura specializzata. I principali limiti del metodo di lettura bulk sono ridotte gamma dinamica rispetto piattaforme gocciolina di conteggio e la necessità di un campione standard, anche se i requisiti di questo standard sono meno rigorosi per un esperimento in tempo reale convenzionale. Quantitative intero amplificazione del genoma (WGA) viene utilizzato per verificare contaminanti nei reazioni WGA ed è il modo più sensibile per rilevare la presenza di frammenti di DNA con sequenze sconosciute, dando il metodo grande promessa in diverse aree applicative, tra cui il controllo farmaceutico di qualità e astrobiologia.

Introduzione

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Saggi digitali per la quantificazione degli acidi nucleici (PCR digitale) 1-4 e la base ordine (sequencing) sono fortemente incidono le scienze della vita e la medicina. Saggi digitali forniscono quantificazione dei conteggi molecolari su scala assoluta (non relativo a un controllo), fornendo l'alta sensibilità, consentendo facili confronti di tutti gli esperimenti, e, soprattutto, permette la costruzione di grandi banche dati contenenti dati comparabili 5 (Tabella 1).

Negli ultimi 15 anni, tutto l'amplificazione del genoma (WGA) è emersa accanto PCR come uno strumento generale per l'ampl....

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Protocollo

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Nota: Realizzazione del dispositivo microfluidico non è necessario per questo test, come goccioline di questo protocollo possono essere formati con i responsabili gocciolina commerciali esistenti 23,29.

1. Effettuare il Droplet formano dispositivo a microfluidi

  1. Preparare stampo master per i canali con il protocollo SU-8 master Fabrication delineato in precedenza 31, ma con un modello di maschera generatore gocciolina 32.
  2. Realizzare dispositivi in PDMS utilizzando le tecniche della litografia soffice 32,33.

2. Preparare miscela di reazi....

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Risultati

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Mentre letture di massa convenzionale / in tempo reale possono essere utilizzati sia per la PCR quantitativa e saggi WGA quantitativi (figura 1), analisi quantitative digitali forniscono vantaggi (Tabella 1). Nel metodo descritto, andremo a leggere saggi digitali in formato micro-goccia con una semplice misura endpoint bulk (Figura 2). Anche se questo metodo è ampiamente applicabile, ci si concentra sulla quantitativa WGA (MDA) perché questo metodo presenta sfide partic.......

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Discussione

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Saggi digitali sono potenti metodi che consentono il rilevamento di cellule rare e conteggio dei singoli di molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali non sono ancora applicati routinariamente nei laboratori di analisi, in parte a causa del costo di attrezzature specializzate associati ai metodi disponibili in commercio. Qui si descrive un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura analogico semplificata utilizzando un real-time quantitativa macchina PCR standard. Questo met.......

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Dichiarazioni

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Il Broad Institute può procedere al deposito di una domanda di brevetto che includa aspetti di questo lavoro.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Liyi Xu per aver fornito reagenti e protocolli MDA. Ringraziamo anche David Feldman e Navpreet Ranu per le discussioni relative a questo lavoro. Questo lavoro è stato in parte supportato da un Burroughs Wellcome Career Award presso lo Scientific Interface to PCB.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Evagreen DyeBiotium31000
Albumina di siero bovinoNew England BiotechnologiesB9000S
Phi29 DNA Polimerasi Reaction Buffer NewEngland BiotechnologiesB0269SVortex periodicamente fino a quando l'aggregato non si dissolve
Lambda DNANew England BiotechnologiesN3011SRiscaldato a 50 oC e spento ghiaccio prima della diluizione
Oligo MDA randomizzati Tecnologieintegrate del DNA 5'-NNNNN*N-3'Primer
PCR Tecnologieintegrate del DNA 5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' e 5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3'
Acqua ultrapura priva di nucleasiLife Technologies10977-015Trattato UV per 30 minuti in Stratalinker 2400 prima dell'uso (opzionale)
Colorante di riferimento ROXLife Technologies12223-012
Tappi per strisce ottiche PCR LifeTechnologies4323032
Provette per PCRAgilent Technologies401428
dNTP (25 micromolari ciascuno)Agilent Tecnologie200415
Termociclatore - Sistema qPCR Mx3000PAgilent Technologies401403
Puntali per pipette barrieraVWR89003-046
Olio Bio-rad per evagreenBio-rad186-4005
JumpStart Taq ReadyMixSigma-AldrichP2893-100RXN

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
  2. Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res.

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Saggi digitalifluorescenza bulksaggi digitali a goccestrumento per PCR in tempo realeformazione delle goccemisurazione della fluorescenzaanalisi della curva standardMDA quantitativoamplificazione dell intero genomaquantificazione delle gocce

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