Enkel Bulk Udlæsning af digitale Nucleic Acid Kvantificering Analyser
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
Digitale assays er kraftfulde metoder, der muliggør detektion af sjældne celler og tælling af individuelle nukleinsyremolekyler. Men digitale assays er stadig ikke rutinemæssigt anvendes, på grund af omkostningerne og særligt udstyr forbundet med kommercielt tilgængelige metoder. Her præsenteres en forenklet metode til udlæsning af digitale droplet assays under anvendelse af en konventionel realtids-PCR instrument til måling hovedparten fluorescens af dråber-baserede digitale assays.
Vi karakteriserer ydeevnen af bulk udlæsning assay under anvendelse af syntetiske dråbe blandinger og en dråbe digitalforstærkning multiple forskydning (MDA) assay. Kvantitativ MDA især fordele fra et digitalt reaktion format, men vores nye metode gælder for alle digitale assay. For etablerede digitale assayprotokoller såsom digital PCR, denne metode tjener til at fremskynde og forenkle analysen udlæsning.
Vores hovedparten udlæsning metode bringer fordelene ved partitioned analyser uden behov for specialiseret udlæsning instrumentering. De vigtigste begrænsninger hovedparten udlæsning metode reduceres dynamikområde sammenlignet med dråbe-optælling platforme og behovet for en standardprøve, selv om kravene til denne standard er mindre krævende end for en konventionel realtid eksperiment. Kvantitativ hele genomamplifikation (WGA) anvendes til at teste for forurenende stoffer i WGA reaktioner og er den mest følsomme måde at detektere tilstedeværelsen af DNA-fragmenter med ukendte sekvenser, der giver fremgangsmåden meget lovende i forskellige anvendelsesområder herunder farmaceutiske kvalitetskontrol og astrobiologi.
Introduction
Digitale assays for nukleinsyre kvantificering (digital PCR) 1-4 og base rækkefølge (sekventering) er stærkt påvirker biovidenskab og medicin. Digitale analyser giver kvantificering af molekylære tællinger på en absolut skala (ikke i forhold til en kontrol), der giver høj følsomhed, så overfladiske sammenligninger på tværs af eksperimenter, og afgørende, så opførelsen af store databaser, der indeholder sammenlignelige data 5 (tabel 1).
Over de sidste 15 år, hel genomamplifikation (WGA) opstået sammen med PCR som et generelt værktøj til nukleinsyreamplifikation. Ligesom PCR, WGA er nyttigt for analytiske og præparative applikationer ved at forstærke minut prøve elementer op til et niveau, der nemt kan opdages eller anvendes til efterfølgende analyser som basis sekventering. I modsætning til PCR, WGA er ikke specifikke for en bestemt DNA-locus, snarere tillader opformering af alle sekvenser i prøven, herunder ukendte sekvenser.Denne grundlæggende forskel mellem PCR og WGA gør de metoder, der supplerer hinanden og giver anledning til forskellige udfordringer i deres ansøgning.
Den højt udbytte af WGA reaktioner 6 muliggør rutinemæssig opformering af genomisk DNA fra enkelte molekyler 7, enkeltceller 8 og andre lav biomasse prøver 9 til kvantificering eller yderligere analyse. De største udfordringer forbundet med WGA kemi er dens ekstreme følsomhed over for forureninger og den ujævne forstærkning tværs individuelle skabelon molekyler 6. Dog er WGA stigende popularitet som encellede sekventering har vist sig som den "killer application" af WGA-teknologi 10 og skabelon kvantificering af WGA er vigtig i mange anvendelsesområder 7.
Instrumentering til digital nukleinsyre kvantificering er tidligere blevet beskrevet i en række ventil og ventilløs mikrofluid formats 11-14, herunder dråbe-baserede assays 15,16 (tabel 2). Men kommercielle mikrofluide systemer til digital analyse kræver specialudstyr til reaktion opsætning og produkt registrering 17. Brugerdefineret ventilforsynede mikrofluidik er fleksible, men kræver præcision mikrofabrikation og pneumatiske kontrolsystemer 18. Selv om det er relativt enkelt at gøre monodisperse mikro-dråber til emulsion-baserede digitale assays 19,20, digital udlæsning er teknisk besværlig, kræver enten store Vidvinkelbilledet imaging (svarende til populære næste generations sekventering teknologier) 21,22 eller højhastigheds-flow-baserede dråbe afsløring 23-25. Ideelt set ville en digital assay være enkel fra set-up til udlæsning, hvilket reducerer behovet for komplekse instrumentering og tillade et stort antal prøver, der skal udlæses hurtigt. Her beskriver vi en forenklet metode til udlæsning af digitale droplet assays, der bruger et konventionelt realtids-PCR instrument at måle fluorescens hovedparten af dråber-baserede digitale assays.
Selv om den nye metode kan anvendes til digitale PCR-assays, er det særligt fordelagtigt for digitale WGA assays for hvilke analog realtid amplifikationsassays (som giver gode resultater for PCR) er problematiske. WGA er almindeligt anvendt på prøver med template molekyler, der er heterogene i rækkefølge, længde og baseindhold. Disse forskellige templatemolekyler amplificeres ved forskellige hastigheder 6, hvilket nødvendiggør anvendelsen af en reference ("standard") prøve med matchende egenskaber. Ofte sådan standard ikke er tilgængelig, eller egenskaberne ved de indkommende prøver er ukendte. Heterogenitet input materiale og længde-afhængig egenskab ved WGA kemier 26 også komplicere fortolkning af resultater ved at skabe uklarhed i, hvad der bliver kvantificeres – input masse, input antal molekyler, en kombination af de to, eller ingen af delene. Finally, sekvensen-ikke-specificitet gør kvantitativ forstærkning multipel forskydning (MDA) mere følsomme over for forurening end kvantitativ PCR siden forurenende molekyler af enhver sekvens har et potentiale til at blande sig. Mikrofluide digitale assays behandle forurening med adskillelse templatemolekyler og reducere reaktionsvolumener, således at færre kontaminanter samples.
Her bruger vi en populær isotermiske WGA metode, MDA 27. Notatet flere andre WGA kemier herunder PicoPlex og MALBAC 28 afhænger afgørende af indledende skridt isoterm strengdeplacering. Isotermiske trin forværre den udfordring at anvende analoge realtid analyser til kvantitativ WGA. WGA kan hverken helt forhindres under opsætningen, hvilket fører til uønsket præ-variabel forstærkning, eller diskretiseres ("cykluser") på en måde, replikation af heterogene molekyler kan drives til færdiggørelse og stoppet før den næste cyklus som PCR 11 </sup> (figur 1). En digital assay format til WGA rumme typiske reaktion opsætning på grund af adskillelsen af hvert molekyle til tælling ved analysen endpoint (så pre-forstærkning påvirker ikke resultaterne) original udlæsning betyder nøjagtighed ville være stort set uafhængig af variationer i forstærkning effektivitet.
Analysen afhænger af dråber produceret i olie med ensartede mængder, som signalniveauet pr dråbe ved analysen endepunkt vil afhænge af dråben volumen, og vi ønsker ikke konsistensen af resultaterne til at afhænge af gennemsnit på tværs af en fordeling af dråbestørrelser. Making monodisperse dråber er nu en standardprocedure (ca. 3.500 monodisperse dråbe papirer er blevet offentliggjort siden 2013), men kræver mikrofluid instrumentering 25. Faktisk har mere end seks selskaber udviklet selvstændige kommercielle produkter, der er afhængige af produktionen af sådanne dråber, og dråbe-making mikrofluide chips erkommercielt tilgængelig 23,29. Til denne undersøgelse anvendte vi tilpassede mikrofluidenheder fremstillet in-house (se protokol). Sprøjtepumper at drive strømmen gennem enhederne er også kommercielt tilgængelige, men kan alternativt være substitueret med en enkelt engangssprøjte til vakuum-drevet flow at reducere omkostningerne 30.
Protocol
Representative Results
Discussion
Digitale assays er kraftfulde metoder, der muliggør detektion af sjældne celler og tælling af de enkelte af nukleinsyremolekyler. Imidlertid digitale assays stadig ikke rutinemæssigt anvendes i analyselaboratorier, dels på grund af udgifterne til specialudstyr forbundet med kommercielt tilgængelige metoder. Her beskriver vi et endepunkt digital assay til kvantificering af nukleinsyrer med en forenklet analog udlæsning ved anvendelse af en standard realtid kvantitativ PCR maskine. Denne metode er hurtig at sætte …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
Riferimenti
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O’Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- . Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip.. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. . Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- Hindson, B. J. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
