Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
Digitale Assays sind leistungsfähige Methoden, die Detektion von seltenen Zellen und Zählung von einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digitale Assays noch nicht routinemäßig angewendet wird, aufgrund der Kosten und spezielle Ausstattung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden. Hier präsentieren wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen der digitalen Tröpfchentests unter Verwendung einer herkömmlichen Echtzeit-PCR-Instrument, um Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen.
Wir charakterisieren die Leistung des Schüttauslese Assays unter Verwendung synthetischer Gemische Tröpfchen und Tröpfchen digitalen Multiple Displacement Amplifikation (MDA) Assay. Quantitative MDA besonders profitiert von einer digitalen Reaktions Format, aber unsere neue Verfahren gilt für alle digitalen Assay. Für etablierte digitale Assay-Protokolle wie digitale PCR dient dieses Verfahren zu beschleunigen und zu vereinfachen Assay Auslesen.
Unsere Großauslesemethode bringt die Vorteile der partitioned Assays ohne die Notwendigkeit für spezielle Auslese Instrumentierung. Die wichtigsten Einschränkungen des Schüttauslesemethode verglichen mit Tropfenzählen Plattformen und die Notwendigkeit für eine Standardprobe reduzierten dynamischen Bereich, wobei die Anforderungen an diese Norm sind weniger anspruchsvoll als für einen herkömmlichen Echtzeit-Experiments. Quantitative Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) wird verwendet, um für Kontaminanten in WGA Reaktionen testen und ist das empfindlichste Art und Weise, um die Anwesenheit von DNA-Fragmenten mit unbekannten Sequenzen zu erkennen, was das Verfahren sehr vielversprechend in unterschiedlichsten Anwendungsbereichen einschließlich der pharmazeutischen Qualitätskontrolle und Astrobiologie.
Introduction
Digitale Assays zur Nukleinsäurequantifizierung (digital PCR) 1-4 und Basis Ordnung (Sequenzierung) stark beeinflussen die Lebenswissenschaften und der Medizin. Digitale Assays stellen die Quantifizierung molekularer zählt auf einer absoluten Skala (nicht relativ zu einer Kontrolle) und bietet hohe Empfindlichkeit und ermöglicht einfache Vergleiche zwischen den Experimenten und entscheidend, so dass der Bau von großen Datenbanken mit vergleichbaren Daten 5 (Tabelle 1).
Im Laufe der letzten 15 Jahre, Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) entstanden neben PCR als allgemeines Instrument für die Nukleinsäure-Amplifikation. Wie PCR ist WGA nützlich für analytische und präparative Anwendungen durch Verstärken Minute Probenelemente bis zu einer Höhe, die leicht nachgewiesen oder für spätere Analysen wie Basensequenzierung verwendet werden kann. Im Gegensatz zur PCR ist WGA nicht speziell auf eine bestimmte DNA-Locus, sondern ermöglicht Amplifikation aller Sequenzen in der Probe, einschließlich der unbekannten Sequenzen.Dieser fundamentale Unterschied zwischen der PCR und WGA macht die Verfahren zueinander komplementär und gibt Anlass zu verschiedenen Herausforderungen in ihrer Anwendung.
Die hohe Ausbeute an WGA Reaktionen 6 ermöglicht Routine-Amplifikation von genomischer DNA aus einzelnen Molekülen 7. Einzelzellen 8 und andere niederBiomasseProben 9 für die Quantifizierung oder eine weitere Analyse. Die großen Herausforderungen mit WGA Chemie verbunden sind seine extreme Empfindlichkeit gegenüber Verunreinigungen und die ungleichmäßige Verstärkung über einzelne Templatmoleküle 6. Allerdings WGA ist an Popularität gewinnt als Single-Cell-Sequenzierung wurde als "Killer-Applikation" des WGA-Technologie 10 und Template-Quantifizierung durch WGA taucht ist in vielen Anwendungsbereichen 7 wichtig.
Instrumentation für digitale Nukleinsäure Quantifizierung wurde zuvor in einer Vielzahl von mit Ventilen und ventillose mikrofluidischen forma beschriebents 11-14 einschließlich tröpfchenbasierten Assays 15,16 (Tabelle 2). , Kommerzielle mikrofluidische Systeme für die digitale Analyse erfordern jedoch Spezialausrüstung für die Reaktionsaufbau und Produkterkennung 17. Benutzerdefinierte Ventil versehenen Mikrofluidik sind flexibel, erfordern aber präzise Mikrofabrikation und pneumatischen Steuerungen 18. Während es relativ einfach ist, monodisperse Mikrotröpfchen zur Emulsionsbasis digitale Assays 19,20 zu machen, ist Digitalanzeige technisch aufwendig und erfordert entweder große Weitfeld-Bildgebung (ähnlich beliebten Next-Generation-Sequencing-Technologien) 21,22 oder High-Speed-Flow-basierte Tröpfchenerkennung 23-25. Im Idealfall, eine digitale Assay wäre einfach vom Set-up, um auszulesen, reduzieren die Notwendigkeit für komplexe Instrumentierung und so eine große Anzahl von Proben schnell ausgelesen werden. Hier beschreiben wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen von digitalen Tröpfchen Assays, die einen herkömmlichen Echtzeit-PCR verwendet instrument zur Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen.
Für digitale WGA Assays für welche analoge Echtzeit-Amplifikationsassays (die ausgezeichnete Ergebnisse liefern für PCR) sind problematisch, besonders vorteilhaft, während der neue Ansatz kann auf digitale PCR-Assays angewendet werden, ist es. WGA gemeinhin Proben mit Templat-Molekülen, die unterschiedlich in Sequenz, Länge und Basengehalt angewandt. Diese unterschiedlichen Templat-Molekülen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit 6 verstärkt, was die Verwendung einer Referenz ("standard") Probe mit passenden Eigenschaften. Oft ist eine solche Standard verfügbar sind oder die Eigenschaften der eingehenden Proben unbekannt sind. Die Heterogenität des Eingangsmaterials und längenabhängigen Eigenschaft des WGA-Chemie 26 die Interpretation der Ergebnisse erschweren auch durch die Schaffung von Mehrdeutigkeit, was wird quantifiziert – die Eingangsmasse, Eingangs Anzahl der Moleküle, die eine Kombination der beiden, oder auch nicht. Fsprünglich, die nicht-sequenz Spezifität macht quantitative mehrere Displacement Amplification (MDA) mehr empfindlich gegenüber Verunreinigungen als quantitative PCR, da Schadstoffmoleküle einer beliebigen Sequenz haben ein Potential, sich einzumischen. Mikrofluidischen digitale Assays Adresse Kontamination durch Trennung Templatmoleküle und die Verringerung der Reaktionsvolumina, so dass weniger Schadstoffe abgetastet werden.
Hier verwenden wir ein beliebtes isothermen WGA-Methode, MDA 27. Zu beachten ist, mehrere andere WGA Chemie einschließlich PicoPlex und MALBAC 28 hängen entscheidend von Anfangs isotherme Strangverdrängungsschritte. Isothermen Stufen verstärken die Herausforderung der Anwendung von analogen Echtzeit-Assays für die quantitative WGA. WGA weder vollständig während der Einrichtung verhindert werden, was zu unerwünschten variable Vorverstärkung, noch diskretisiert ("getaktet") in einer Weise, wo die Replikation des heterogenen Moleküle vollständig durchgeführt und gestoppt werden, bevor der nächste Zyklus wie PCR 11 </sup> (1). Ein digitales Testformat für WGA empfängt typische Reaktions Setup-Verfahren aufgrund der Segregation von jedem Molekül zur Zählung im Assayendpunkt (so Vorverstärkung beeinflußt die Treffer) Originalausleseeinrichtung Genauigkeit würde weitgehend unabhängig von Variationen in der Amplifikationseffizienz ist.
Der Test ist abhängig von Tröpfchen in Öl mit einheitlichen Mengen hergestellt, wie der Signalpegel pro Tröpfchen in der Assay-Endpunkt wird auf dem Tröpfchenvolumen abhängen, und wir wollen nicht, dass die Konsistenz der Ergebnisse auf Mittelung über eine Verteilung der Tröpfchengrößen abhängen. Erstellen monodisperse Tröpfchen ist heute ein Standardverfahren (etwa 3.500 monodisperse Tröpfchen Papiere sind seit 2013 erschienen), erfordert aber mikrofluidischen Instrumentierung 25. In der Tat haben mehr als sechs Unternehmen entwickelt unabhängige kommerzielle Produkte, die auf die Produktion von solchen Tröpfchen verlassen und Tröpfchenherstellung mikrofluidischen Chipsim Handel erhältlich 23,29. Für diese Studie verwendeten wir kundenspezifische Mikrofluidvorrichtungen in-house (siehe Protokoll) hergestellt. Spritzenpumpen zu fahren Flusses durch die Vorrichtungen sind auch im Handel erhältlich, aber alternativ mit einem einzigen Einmalspritze zur Vakuum angetriebenen Strömungs substituiert werden, um die Kosten von 30 reduzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Digital Assays sind leistungsfähige Methoden, die den Nachweis von seltenen Zellen und Zählen der einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digital Assays sind noch nicht routinemäßig in analytischen Labors zu den Kosten von Spezialausrüstung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden angewendet, die teilweise. Hier beschreiben wir einen Endpunkt digitalen Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten analogen Auslese Verwendung eines Standard quantitative Echtzeit-PCR-Mas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
Riferimenti
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