Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
Saggi digitali sono potenti metodi che permettono il rilevamento di cellule rare e il conteggio delle singole molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali sono ancora abitualmente applicata, a causa del costo e attrezzature specifiche associati ai metodi disponibili in commercio. Qui vi presentiamo un metodo semplificato per la lettura di saggi gocciolina digitali utilizzando uno strumento di PCR in tempo reale convenzionale per misurare la fluorescenza massa di saggi digitali basate goccioline-.
Abbiamo caratterizzare le prestazioni del test lettura bulk utilizzando miscele gocciolina sintetici e digitale dosaggio gocciolina multiple displacement amplification (MDA). Quantitative MDA particolare beneficia di un formato di reazione digitale, ma il nostro nuovo metodo si applica a qualsiasi dosaggio digitale. Per i protocolli di analisi digitali affermati come la PCR digitale, questo metodo serve ad accelerare e semplificare test di lettura.
La nostra metodologia di massa lettura porta i vantaggi di partitionesaggi d senza la necessità di strumentazione lettura specializzata. I principali limiti del metodo di lettura bulk sono ridotte gamma dinamica rispetto piattaforme gocciolina di conteggio e la necessità di un campione standard, anche se i requisiti di questo standard sono meno rigorosi per un esperimento in tempo reale convenzionale. Quantitative intero amplificazione del genoma (WGA) viene utilizzato per verificare contaminanti nei reazioni WGA ed è il modo più sensibile per rilevare la presenza di frammenti di DNA con sequenze sconosciute, dando il metodo grande promessa in diverse aree applicative, tra cui il controllo farmaceutico di qualità e astrobiologia.
Introduction
Saggi digitali per la quantificazione degli acidi nucleici (PCR digitale) 1-4 e la base ordine (sequencing) sono fortemente incidono le scienze della vita e la medicina. Saggi digitali forniscono quantificazione dei conteggi molecolari su scala assoluta (non relativo a un controllo), fornendo l'alta sensibilità, consentendo facili confronti di tutti gli esperimenti, e, soprattutto, permette la costruzione di grandi banche dati contenenti dati comparabili 5 (Tabella 1).
Negli ultimi 15 anni, tutto l'amplificazione del genoma (WGA) è emersa accanto PCR come uno strumento generale per l'amplificazione degli acidi nucleici. Come PCR, WGA è utile per le applicazioni analitiche e preparative amplificando elementi minuto di campionamento fino a un livello che può essere facilmente individuata o utilizzati per le successive analisi, come il sequenziamento di base. A differenza di PCR, WGA non è specifico per un particolare locus DNA, piuttosto che permette l'amplificazione di tutte le sequenze del campione, tra le sequenze sconosciute.Questa differenza fondamentale tra PCR e WGA rende i metodi complementari tra loro e dà luogo a diversi problemi nella loro applicazione.
L'alto rendimento di reazioni WGA 6 consente l'amplificazione di routine di DNA genomico da molecole singole 7, celle singole 8 e altri campioni a bassa biomassa 9 per la quantificazione e ulteriori analisi. Le sfide principali associate alla WGA chimica sono la sua estrema sensibilità ai contaminanti e l'amplificazione irregolare attraverso singole molecole modello 6. Tuttavia, WGA sta guadagnando popolarità come il sequenziamento di singole cellule è emerso come il "killer application" della tecnologia WGA 10, e il modello di quantificazione da WGA è importante in molti campi di applicazione 7.
Strumentazione per il digitale quantificazione di acidi nucleici è stata precedentemente descritta in una varietà di con valvola e senza valvole forma microfluidicats 11-14, tra saggi basati gocciolina-15,16 (Tabella 2). Tuttavia, i sistemi microfluidici commerciali per l'analisi digitale richiedono attrezzature specializzate per la configurazione di reazione e la rilevazione dei prodotti 17. Microfluidica personalizzati valvolati sono flessibili, ma richiedono precisione microfabbricazione e sistemi di controllo pneumatici 18. Mentre è relativamente semplice da fare monodisperse micro-goccioline di emulsione a base-saggi digitali 19,20, lettura digitale è tecnicamente gravoso, che richiede sia su larga scala di immagini a grande campo (simile alle famose tecnologie di sequenziamento di prossima generazione) o 21,22 ad alta velocità del flusso basato sul rilevamento delle gocce 23-25. Idealmente, un saggio digitale sarebbe semplice dal set-up di lettura, riducendo la necessità di strumentazione complessa e consentendo un gran numero di campioni da leggere rapidamente. Qui si descrive un metodo semplificato per la lettura dei saggi goccioline digitali che utilizza un convenzionale PCR in tempo reale iNstrument per misurare la fluorescenza massa di saggi digitali basate goccioline-.
Mentre il nuovo approccio può essere applicato a PCR digitali, è particolarmente vantaggioso per le analisi WGA digitali che analogici dosaggi di amplificazione in tempo reale (che danno risultati eccellenti per PCR) sono problematici. WGA è comunemente applicato a campioni con molecole modello eterogenee in sequenza, lunghezza, e il contenuto di base. Queste diverse molecole modello vengono amplificati a tassi differenti 6, rendendo necessario l'uso di un riferimento ("standard") campione con caratteristiche corrispondenti. Spesso, tale standard è disponibile, o le caratteristiche dei campioni in ingresso sono sconosciute. L'eterogeneità del materiale in ingresso e la proprietà lunghezza-dipendente delle farmacie WGA 26 inoltre complicare l'interpretazione dei risultati creando ambiguità quanto viene quantificato – la massa di ingresso, il numero di molecole di ingresso, una combinazione dei due, o nessuno. Finalmente, la sequenza non specificità rende quantitativo spostamento amplificazione multipla (MDA) più sensibili alla contaminazione di PCR quantitativa in quanto le molecole contaminanti di qualsiasi sequenza hanno un potenziale di interferire. Saggi digitali microfluidica affrontare la contaminazione separando le molecole di modello e di ridurre i volumi di reazione in modo tale che un minor numero di agenti inquinanti vengono campionati.
Qui usiamo un popolare metodo di WGA isotermico, MDA 27. Da segnalare, diversi altri chimiche WGA tra cui PicoPlex e MALBAC 28 dipendono in modo cruciale passi iniziali di spostamento isotermico filo. Passi isotermici aggravano la sfida di applicare analisi real-time quantitativa analogici per WGA. WGA può essere né impossibilitato durante l'installazione, con conseguente indesiderato variabile pre-amplificazione, né discretizzato ("ciclato") in un modo in cui la replica di molecole eterogenee può essere guidato a completamento e fermato prima del ciclo successivo come PCR 11 </sup> (Figura 1). Un formato digitale per test WGA accoglie tipiche procedure di impostazione reazione dovuta alla segregazione di ogni molecola per il conteggio a livello di endpoint del test (in modo pre-amplificazione non influenza il risultato) di lettura originale significa accuratezza sarebbe in gran parte indipendente di variazione in termini di efficienza di amplificazione.
Il dosaggio dipende goccioline nell'olio con volumi uniformi, come il livello del segnale per droplet alla endpoint dosaggio dipenderà dal volume delle gocce, e non vogliamo la coerenza dei risultati dipendono da una media attraverso una distribuzione di dimensioni delle gocce. Fare goccioline monodisperse ora è una procedura standard (circa 3.500 documenti gocciolina monodisperse sono stati pubblicati dal 2013), ma richiede strumentazione microfluidica 25. In realtà, più di sei aziende hanno sviluppato prodotti commerciali indipendenti che si basano sulla produzione di tali goccioline, e chip microfluidici-gocciolina fare sonocommercialmente disponibile 23,29. Per questo studio, abbiamo utilizzato dispositivi microfluidici personalizzato autoprodotti (vedi Protocol). Siringa Pompe per guidare il flusso attraverso i dispositivi sono anche disponibili in commercio, ma in alternativa, può essere sostituito con una singola siringa monouso per flusso guidato-vuoto per ridurre i costi 30.
Protocol
Representative Results
Discussion
Saggi digitali sono potenti metodi che consentono il rilevamento di cellule rare e conteggio dei singoli di molecole di acido nucleico. Tuttavia, i saggi digitali non sono ancora applicati routinariamente nei laboratori di analisi, in parte a causa del costo di attrezzature specializzate associati ai metodi disponibili in commercio. Qui si descrive un saggio digitale endpoint per quantificare gli acidi nucleici con una lettura analogico semplificata utilizzando un real-time quantitativa macchina PCR standard. Questo met…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
Riferimenti
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