Enkelt Bulk Avlesning av digitale Nukleinsyre Kvantifisering Analyser
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
Digitale analyser er kraftige metoder som muliggjør påvisning av sjeldne celler og telling av individuelle nukleinsyremolekyler. Imidlertid digitale analyser er fortsatt ikke rutinemessig anvendt, på grunn av kostnader og spesielle utstyr i forbindelse med kommersielt tilgjengelige metoder. Her presenterer vi en forenklet metode for avlesning av digitale dråpe analyser ved anvendelse av en konvensjonell real-time PCR instrument for å måle bulk fluorescens av dråpebasert digital-analyser.
Vi karakterisere ytelsen av bulk avlesning analyse ved bruk av syntetiske dråpe blandinger og en dråpe digital multippel forskyvning forsterkning (MDA) assay. Kvantitativ MDA spesielt nytte av en digital reaksjon format, men vår nye metoden gjelder for alle digitale analysen. For etablerte digitale analyseprotokoller som digital PCR, fungerer denne metoden for å fremskynde og forenkle analysen avlesning.
Våre bulk avlesning metodikk bringer fordelene med partitioned analyser uten behov for spesialisert avlesning instrumentering. De viktigste begrensninger av bulk avlesning metodikken er redusert dynamisk område, sammenlignet med dråpetelle plattformer og behovet for en standardprøve, selv om kravene til denne standarden er mindre krevende enn for en konvensjonell sanntids forsøk. Kvantitativ hele genomet forsterkning (WGA) brukes til å teste for forurensninger i WGA-reaksjoner, og er den mest følsomme måte for å påvise tilstedeværelsen av DNA-fragmenter med ukjente sekvenser, noe som gir metoden store løftet i ulike bruksområder, inkludert farmasøytisk kvalitetskontroll og astrobiologi.
Introduction
Digitale analyser for nukleinsyre kvantifisering (digital PCR) 1-4 og basen rekkefølge (sekvensering) er sterkt påvirket biovitenskap og medisin. Digitale analyser tilveie kvantifisering av molekyl tellinger på en absolutt skala (ikke i forhold til en kontroll), som gir høy følsomhet, slik at lettvinte sammenligninger på tvers av eksperimenter, og viktigst, som muliggjør bygging av store databaser som inneholder sammenlignbare data 5 (Tabell 1).
I løpet av de siste 15 årene, dukket hele genomet forsterkning (WGA) sammen med PCR som et generelt verktøy for nukleinsyre forsterkning. Som PCR, er WGA nyttig for analytisk og preparativ programmer ved å forsterke liten prøveelementer opp til et nivå som kan lett oppdages eller brukes for senere analyser som utgangspunkt sekvensering. I motsetning til PCR, er WGA ikke er spesifikk for en bestemt DNA-locus, i stedet for å tillate amplifisering av alle sekvenser i prøven, inkludert ukjente sekvenser.Denne fundamentale forskjell mellom PCR og WGA gjør metodene komplementære til hverandre og gir opphav til ulike utfordringer i søknaden.
Den høye utbyttet av WGA reaksjoner 6 muliggjør rutine forsterkning av genomisk DNA fra enkle molekyler 7, enkeltceller 8 og andre med lav biomasse prøvene 9 for kvantifisering eller videre analyse. De største utfordringene knyttet til WGA kjemi er det ekstrem følsomhet for forurensninger og ujevn forsterkning over individuelle templatmolekyler 6. Imidlertid er WGA stadig mer populært som encellede sekvensering har dukket opp som den "killer application" av WGA teknologi 10, og mal kvantifisering av WGA er viktig i mange bruksområder 7.
Instrumentering for digital nukleinsyre kvantifisering har tidligere blitt beskrevet i en rekke av ventil og ventilløse mikrofluid formats 11-14, inkludert dråpebaserte assays 15,16 (tabell 2). Men kommersielle microfluidic systemer for digital analyse krever spesialisert utstyr for reaksjon oppsett og produkt deteksjon 17. Custom ventilstyrte MicroFluidics er fleksible, men krever presisjon microfabrication og pneumatiske kontrollsystemer 18. Selv om det er relativt enkelt å lage monodisperse mikrodråper emulsjonsbaserte digitale assays 19,20, er digital avlesning teknisk tunge, og krever enten store vidvinkel avbildning (tilsvarende populære neste generasjons sekvense teknologier) 21,22 eller Høyhastighets Flow-basert dråpe deteksjon 23-25. Ideelt sett ville en digital assay være enkel fra set-up til avlesning, og reduserer behovet for komplisert instrumentering og tillate et stort antall prøver for å bli lest ut raskt. Her beskriver vi en forenklet metode for avlesning av digitale dråpe analyser som anvender en konvensjonell real-time PCR instrument å måle bulk fluorescens av dråpe-baserte digitale analyser.
Samtidig som den nye metode kan anvendes på digitale PCR-analyser, er det spesielt fordelaktig for digitale WGA-analyser hvor det analoge sanntids amplifikasjonsanalyser (som gir utmerkede resultater for PCR) er problematisk. WGA er vanlig anvendt på prøver med mal molekyler som er heterogene i sekvens, lengde og baseinnhold. Disse ulike templatmolekyler er forsterket med forskjellige satser 6, hvilket nødvendiggjør bruk av en referanse ("standard") prøve med passende egenskaper. Ofte er noen slik standard er tilgjengelig, eller egenskapene til de innkommende prøver er ukjent. Heterogeniteten av inngangsmaterialet og lengdeavhengig egenskap av WGA kjemi 26 også komplisere tolkningen av resultatene ved å skape tvetydighet i det som blir kvantifisert – inngangs masse, inn antallet molekyler, en kombinasjon av de to, eller ingen av delene. Finally, gjengir sekvens-non-spesifisitet kvantitativ multippel forskyvning forsterkning (MDA) mer følsom for forurensning enn kvantitativ PCR, siden forurensende molekyler med en hvilken som helst sekvens har et potensial til å gripe inn. Microfluidic digitale analyser adressere forurensning av segregerende templatmolekyler og redusere reaksjonsvolumer slik at færre forurensninger samples.
Her bruker vi en populær isotermisk WGA metode, MDA 27. Av notatet, flere andre WGA kjemi inkludert PicoPlex og MALBAC 28 avhenger avgjørende på initielle isotermisk tråd fortrengning trinn. Isoterme skritt forverre utfordringen med å søke analoge sanntids analyser for kvantitativ WGA. WGA kan verken helt forhindret under oppsett, som fører til uønsket variabel pre-forsterkning, og heller diskretisert ("syklet") på en måte der replikering av heterogene molekyler kan bli kjørt til ferdigstillelse og stoppet før neste syklus som PCR 11 </sup> (figur 1). En digital analyse format for WGA plass typiske reaksjonen oppsettsprosedyrer grunn av segregering av hvert molekyl for telling på analysepunktet (så pre-forsterkning påvirker ikke resultatene) original avlesning betyr nøyaktighet ville være uavhengige av variasjon i forsterkning effektivitet.
Analysen avhenger av dråper produseres i olje med ensartede volumer, som signalnivået per dråpe ved analysen endepunkt vil avhenge av dråpevolum, og vi ønsker ikke at konsistensen av resultatene for å stole på i snitt på tvers av en fordeling av dråpestørrelser. Making monodisperse dråper er nå en standard prosedyre (ca 3500 monodisperse dråpe papirer har blitt utgitt siden 2013), men krever microfluidic instrumentering 25. Faktisk har mer enn seks selskaper utviklet uavhengige kommersielle produkter som er avhengige av produksjonen av slike dråper, og dråpe lage microfluidic chips erkommersielt tilgjengelig 23,29. For denne studien brukte vi tilpasset microfluidic enheter produsert in-house (se Protocol). Sprøytepumper for å drive strømmen gjennom enhetene er også kommersielt tilgjengelige, men kan alternativt være substituert med en enkelt engangssprøyte for vakuumdrevet strømning for å redusere kostnadene 30.
Protocol
Representative Results
Discussion
Digitale analyser er kraftige metoder som muliggjør påvisning av sjeldne celler og telling av individuelle av nukleinsyremolekyler. Imidlertid digitale analysene er fortsatt ikke rutinemessig anvendt i analytiske laboratorier, delvis på grunn av kostnaden av spesialisert utstyr i forbindelse med kommersielt tilgjengelige metoder. Her beskriver vi et endepunkt digital analyse for kvantifisering av nukleinsyrer med en forenklet analog avlesning ved anvendelse av en standard sanntids kvantitativ PCR maskinen. Denne meto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
Riferimenti
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O’Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- . Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip.. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. . Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- Hindson, B. J. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
