Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y recuento de moléculas de ácido nucleico individuales. Sin embargo, los ensayos digitales son todavía no se aplican de forma rutinaria, debido al coste y equipos específicos asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí presentamos un método simplificado para la lectura de las pruebas de gota digitales utilizando un instrumento convencional PCR en tiempo real para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados en gotas.
Caracterizamos el rendimiento del ensayo de lectura mayor usando mezclas de gotitas sintético y un digital de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) de ensayo de gotas. Cuantitativa MDA en particular se beneficia de un formato digital de la reacción, pero nuestro nuevo método se aplica a cualquier ensayo digital. Para protocolos de ensayo digitales establecidos, tales como PCR digital, este método sirve para acelerar y simplificar la lectura del ensayo.
Nuestra metodología de lectura mayor aporta las ventajas de partitioned ensayos sin la necesidad de la instrumentación de lectura especializada. Las principales limitaciones de la metodología de lectura mayor se reducen rango dinámico en comparación con las plataformas de gotita de conteo y la necesidad de una muestra estándar, aunque los requisitos de esta norma son menos exigentes que para un experimento en tiempo real convencional. La amplificación del genoma completo cuantitativa (WGA) se utiliza para probar los contaminantes presentes en las reacciones de Ventajas de Windows Original y es la forma más sensible para detectar la presencia de fragmentos de ADN con secuencias desconocidas, dando el método de gran promesa en diversas áreas de aplicación incluyendo control de calidad farmacéutica y la astrobiología.
Introduction
Ensayos digitales para la cuantificación de ácidos nucleicos (PCR digital) 1.4 y la base de la orden (secuencia) están impactando fuertemente las ciencias de la vida y la medicina. Digitales proporcionan ensayos de cuantificación de los recuentos moleculares en una escala absoluta (no respecto a un control), proporcionando una alta sensibilidad, lo que permite comparaciones fáciles a través de experimentos, y crucial, lo que permite la construcción de grandes bases de datos que contienen datos comparables 5 (Tabla 1).
En los últimos 15 años, la amplificación del genoma (WGA) surgió junto PCR como una herramienta general para la amplificación de ácidos nucleicos. Al igual que la PCR, WGA es útil para aplicaciones analíticas y preparativas por amplificación de elementos de la muestra minuto hasta un nivel que puede ser fácilmente detectado o utilizado para los análisis posteriores, como la secuenciación de base. A diferencia de PCR, WGA no es específico de un locus particular de ADN, en lugar permitiendo la amplificación de todas las secuencias en la muestra, incluyendo secuencias desconocidas.Esta diferencia fundamental entre la PCR y WGA hace que los métodos complementarios entre sí y da lugar a diferentes desafíos en su aplicación.
El alto rendimiento de las reacciones de WGA 6 permite la amplificación rutinaria de ADN genómico a partir de moléculas individuales 7, células individuales 8 y otras muestras de baja biomasa 9 para la cuantificación o análisis adicional. Los principales desafíos relacionados con la química WGA son su extrema sensibilidad a los contaminantes y la amplificación desigual entre moléculas plantilla individuales 6. Sin embargo, WGA está ganando popularidad como la secuenciación de una sola célula se ha convertido en la "aplicación asesina" de la tecnología WGA 10, y la plantilla de la cuantificación de Ventajas de Windows Original es importante en muchos campos de aplicación 7.
Instrumentación para la cuantificación de ácido nucleico digital ha sido descrita previamente en una variedad de válvula y sin válvula forma de microfluidosts 11-14, incluyendo ensayos basados en gotitas 15,16 (Tabla 2). Sin embargo, los sistemas de microfluidos comerciales para análisis digital requieren equipo especializado para la configuración de la reacción y la detección del producto 17. Microfluidos con válvula de encargo son flexibles, pero requieren de microfabricación de precisión y sistemas de control neumático 18. Si bien es relativamente sencillo de hacer monodispersas micro-gotas para los ensayos digitales basados en emulsión 19,20, lectura digital es técnicamente onerosa, que requiere de formación de imágenes de campo amplio a gran escala (similar a las tecnologías de secuenciación populares de próxima generación) o 21,22 de alta velocidad de flujo basados en la detección de gotas 23-25. Idealmente, un ensayo digitales sería simple a partir de la configuración de lectura de salida, reduciendo la necesidad de instrumentación compleja y permitiendo que un gran número de muestras para ser leído rápidamente. Aquí se describe un método simplificado para la lectura de los ensayos de gotitas digital que utiliza un tiempo real PCR convencional iNSTRUMENTO para medir la fluorescencia mayor parte de los ensayos digitales basados en gotas.
Mientras que el nuevo enfoque puede aplicarse a los ensayos de PCR digitales, es particularmente ventajoso para los ensayos de WGA digitales para el cual analógica ensayos de amplificación en tiempo real (que dan excelentes resultados para la PCR) son problemáticos. Ventajas de Windows Original se aplica comúnmente a las muestras con las moléculas de plantilla que son heterogéneos en secuencia, longitud y contenido de la base. Estas diferentes moléculas de molde se amplifican a diferentes velocidades 6, lo que exige el uso de una referencia ("estándar") muestra con características coincidentes. A menudo, no hay tal estándar está disponible, o las características de las muestras entrantes son desconocidos. La heterogeneidad del material de entrada y la propiedad dependiente de la longitud de químicas de WGA 26 también complicar la interpretación de los resultados mediante la creación de ambigüedad en lo que se está cuantificado – la masa de entrada, el número de moléculas de entrada, una combinación de los dos, o ninguno. Finalmente, la secuencia de no especificidad de amplificación del desplazamiento hace que múltiple cuantitativa (MDA) más sensibles a la contaminación que la PCR cuantitativa ya que las moléculas contaminantes de cualquier secuencia tienen un potencial de interferir. Ensayos digitales microfluidos abordar la contaminación por segregar moléculas plantilla y la reducción de los volúmenes de reacción tales que menos contaminantes se muestrean.
Aquí se utiliza un método WGA isotérmica popular, MDA 27. Es de destacar que varias otras químicas WGA incluyendo PicoPlex y MALBAC 28 dependen crucialmente de pasos iniciales de desplazamiento de hebra isotérmica. Pasos isotérmicos exacerban el reto de aplicar ensayos en tiempo real analógicos para WGA cuantitativo. WGA no puede ser ni impidió completamente durante la instalación, lo que lleva a no deseado de pre-amplificación variables, ni discretiza ("ciclado") de una manera donde la replicación de moléculas heterogéneas puede ser conducido a la terminación y se detuvo antes de la siguiente ciclo de PCR como 11 </sup> (Figura 1). Un formato de ensayo digital para WGA acoge procedimientos de configuración reacción típica debido a la segregación de cada molécula para la enumeración en el punto final de ensayo (de modo pre-amplificación no afecta a los resultados) de lectura original significa exactitud sería en gran medida independiente de la variación en la eficiencia de amplificación.
El ensayo depende de las gotitas producidas en aceite con volúmenes uniformes, ya que el nivel de la señal por la gotita en el punto final del ensayo dependerá del volumen de gota, y no queremos que la consistencia de los resultados que dependen de un promedio a través de una distribución de tamaños de gota. Hacer gotitas monodispersas es ahora un procedimiento estándar (alrededor de 3.500 documentos de gotitas monodispersas se han publicado desde 2013), sino que requiere la instrumentación de microfluidos 25. De hecho, más de seis empresas han desarrollado productos comerciales independientes que dependen de la producción de este tipo de gotas, y los chips de microfluidos gotitas de decisiones sondisponible comercialmente 23,29. Para este estudio, se utilizaron dispositivos de microfluidos encargo de fabricación propia (véase el Protocolo). Las bombas de jeringa para conducir el flujo a través de los dispositivos también están disponibles comercialmente, pero, alternativamente, puede estar sustituido con un solo jeringa desechable para el flujo impulsado por vacío para reducir los costos 30.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ensayos digitales son poderosos métodos que permiten la detección de células raras y contando de individual de moléculas de ácido nucleico. Sin embargo, los ensayos digitales aún no se aplican de forma rutinaria en los laboratorios de análisis, debido en parte al coste de equipo especializado asociados con los métodos disponibles comercialmente. Aquí se describe un ensayo digital de punto final para la cuantificación de ácidos nucleicos con una lectura analógica simplificada usando una cuantitativa en tiempo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
Riferimenti
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