Enkel Bulk Avläsning av digitala Nucleic Acid Kvantifiering Analyser
Summary
We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.
Abstract
Digitala analyser är kraftfulla metoder som möjliggör detektion av sällsynta celler och räkning av enskilda nukleinsyramolekyler. Emellertid digitala analyser är fortfarande inte rutinmässigt tillämpats, på grund av kostnaden och särskild utrustning associerad med kommersiellt tillgängliga metoder. Här presenterar vi en förenklad metod för avläsning av digitala droppanalyser med användning av en konventionell realtids-PCR instrument för att mäta bulk fluorescens av droppbaserade digitala analyser.
Vi karakteriserar prestandan hos bulk avläsning analys med användning av syntetiska dropp blandningar och en dropp digitalt multipel Displacement Amplification (MDA) -analys. Särskilt fördelar Kvantitativ MDA från en digital reaktions format, men vår nya metod gäller för alla digitala analys. För etablerade digitala analysprotokoll såsom digital PCR, fungerar den här metoden för att påskynda och förenkla analys avläsning.
Vår bulk avläsning metod ger fördelarna med partitioned analyser utan behovet av specialiserad avläsning instrumentering. De huvudsakliga begränsningar bulk avläsning metoden minskar dynamiskt omfång jämfört med droppräknings plattformar och behovet av ett standardprov, även om kraven för denna standard är mindre krävande än för en konventionell realtid experiment. Kvantitativ hela genomet förstärkning (WGA) används för att testa för främmande ämnen i WGA reaktioner och är den mest känsliga sättet att upptäcka närvaron av DNA-fragment med okända sekvenser, vilket ger metoden mycket lovande i olika tillämpningsområden, inklusive läkemedels kvalitetskontroll och astrobiologi.
Introduction
Digitala analyser för nukleinsyra kvantifiering (digital PCR) 1-4 och basorder (sekvensering) starkt påverkar biovetenskap och medicin. Digitala analyser ger kvantifiering av molekylära räknas på en absolut skala (inte i förhållande till en kontroll), vilket ger hög känslighet, vilket möjliggör facile jämförelser mellan experiment, och avgörande, vilket möjliggör byggandet av stora databaser med jämförbara data 5 (tabell 1).
Under de senaste 15 åren, hela genomet förstärkning (WGA) dök upp tillsammans med PCR som ett allmänt verktyg för nukleinsyraamplifiering. Liksom PCR, är WGA användbar för analytiska och preparativa applikationer genom att förstärka minut provelement upp till en nivå som lätt kan upptäckas eller användas för efterföljande analyser som bas sekvensering. Till skillnad från PCR, är WGA inte specifika för en viss DNA-locus, snarare tillåta förstärkning av alla sekvenser i provet, inklusive okända sekvenser.Denna grundläggande skillnad mellan PCR och WGA gör metoder som kompletterar varandra och ger upphov till olika utmaningar i sin ansökan.
Den högt utbyte av WGA reaktioner 6 möjliggör rutin förstärkning av genomiskt DNA från enstaka molekyler 7, enskilda celler 8 och andra låg biomassaprover 9 för kvantifiering eller vidare analys. De största utmaningarna i samband med WGA kemi är dess extrema känslighet för föroreningar och den ojämna förstärkning över enskilda mallmolekylerna 6. Dock är WGA ökar i popularitet som encelliga sekvensering har blivit den "killer application" av WGA teknik 10, och mall kvantifiering av WGA är viktigt i många tillämpningsområden 7.
Instrumentering för digital nukleinsyra kvantifiering har tidigare beskrivits i en mängd olika med och utan ventil mikroflödes formats 11-14, inklusive droppbaserade analyser 15,16 (tabell 2). Men kommersiella mikroflödessystem för digital analys kräver specialutrustning för reaktion installation och produktdetektering 17. Anpassade ventilförsedda mikrofluidik är flexibla, men kräver precision mikro och pneumatiska styrsystem 18. Även om det är relativt enkelt att göra monodispersa mikrodroppar för emulsionsbaserade digitala analyser 19,20, är digital avläsning tekniskt betungande, vilket kräver antingen stora vidvinkel imaging (liknande populära nästa generations sekvenseringsteknologier) 21,22 eller höghastighetsflödesbaserad droppdetektering 23-25. Helst skulle en digital analys vara enkelt från set-up för att avläsning, vilket minskar behovet av komplexa instrument och låta ett stort antal prover som skall läsas ut snabbt. Här beskriver vi en förenklad metod för avläsning av digitala droppanalyser som använder en konventionell realtids-PCR instrument att mäta bulk fluorescens av droppbaserade digitala analyser.
Även kan tillämpas den nya strategin för digitala PCR-analyser, är det särskilt fördelaktigt för digitala WGA analyser för vilka analog realtids amplifieringsanalyser (som ger utmärkta resultat för PCR) är problematiska. WGA är allmänt tillämpas på prov med mallmolekyler som är heterogena i sekvens, längd och bas innehåll. Dessa olika mallmolekyler förstärks i olika takt 6, vilket nödvändiggör användningen av en referens ("standard") prov med matchande egenskaper. Ofta finns ingen sådan standard finns, eller egenskaperna hos de inkommande proverna är okända. Heterogenitet ingångsmaterial och längd beroende egendom WGA kemi 26 också försvåra tolkningen av resultaten genom att skapa oklarhet i vad som kvantifieras – ingångsvikt, input antalet molekyler, en kombination av båda, eller ingetdera. Finally, gör sekvens icke-specificitet kvantitativ multipel förskjutningsförstärkning (MDA) känsligare för föroreningar än kvantitativ PCR eftersom förorenings molekyler av varje sekvens har en potential att störa. Microfluidic digitala analyser adress förorening genom segregerande mallmolekylerna och minska reaktionsvolymer så att färre föroreningar samplas.
Här använder vi en populär isotermiska WGA-metoden, MDA 27. Notera flera andra WGA kemi inklusive PicoPlex och MALBAC 28 beror ytterst på första isotermisk strängförskjutningssteg. Isotermiska steg förvärra utmaningen att tillämpa analoga realtidsanalyser för kvantitativ WGA. WGA kan varken helt förhindras under installationen, vilket leder till oönskade variabel pre-förstärkning, eller diskretiseras ("cyklade") på ett sätt där replikering av heterogena molekyler kan drivas till fullbordan och stoppas innan nästa cykel som PCR 11 </sup> (Figur 1). Ett digitalt analysformat för WGA rymmer typiska reaktionsinställningsprocedurerna på grund av segregeringen av varje molekyl för räkning på analys endpoint (så pre-förstärkning påverkar inte resultatet) ursprungliga avläsning innebär noggrannhet skulle vara i stort sett oberoende av variation i amplifieringseffektivitet.
Analysen är beroende av droppar som produceras i olja med enhetliga volymer, som signalnivån per droppe på analys endpoint kommer att bero på droppvolym, och vi vill inte att resultaten blir konsekventa bero på i genomsnitt över en fördelning av droppstorlekar. Att monodispersa droppar är nu ett standardförfarande (ca 3500 monodispersa dropp artiklar har publicerats sedan 2013), men kräver mikroflödes instrumentering 25. I själva verket har mer än sex företag utvecklat oberoende kommersiella produkter som är beroende av produktionen av sådana droppar och droppfattandet mikrofluid marker ärkommersiellt tillgänglig 23,29. För denna studie använde vi anpassade mikrofluidikanordningar produceras internt (se protokollet). Sprutpumparna för att driva flödet genom anordningarna är också kommersiellt tillgängliga, men alternativt kan vara substituerad med en enda engångsspruta för vakuumdriven strömning för att minska kostnaderna 30.
Protocol
Representative Results
Discussion
Digitala analyser är kraftfulla metoder som möjliggör detektion av sällsynta celler och räkning av individuella av nukleinsyramolekyler. Emellertid digitala analyser fortfarande inte rutinmässigt används i analyslaboratorier, delvis beroende på kostnaderna för specialutrustning associerad med kommersiellt tillgängliga metoder. Här beskriver vi en slutpunkt digital analys för att kvantifiera nukleinsyror med en förenklad analog avläsning med en vanlig realtids kvantitativ PCR maskin. Denna metod är snabb a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.
Materials
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25uM each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler – Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
Riferimenti
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O’Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- . Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip.. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. . Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- Hindson, B. J. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
