Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Summary

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Abstract

Neutrofili, il più abbondante di tutte le cellule bianche del sangue nella circolazione umana, svolgono un ruolo importante nella difesa dell'ospite contro microrganismi invasori. Inoltre, i neutrofili giocano un ruolo centrale nella sorveglianza immunitaria di cellule tumorali. Essi hanno la capacità di riconoscere le cellule tumorali e indurre la morte delle cellule tumorali tramite un meccanismo di contatto-dipendente delle cellule coinvolgono il perossido di idrogeno o attraverso citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC). I neutrofili con attività anti-tumorale possono essere isolate dal sangue periferico di pazienti affetti da cancro e di topi portatori di tumore. Questi neutrofili sono chiamati neutrofili tumore trascinato (TEN) per distinguerli dai neutrofili di soggetti sani o topi ingenua che non mostrano una significativa attività citotossica tumorale. Rispetto ad altri globuli bianchi, neutrofili mostrano diversa galleggiabilità rendendo così possibile ottenere a> 98% popolazione neutrofili puro quando sottoposto ad un gradiente di densità. Tuttavia, in aggiuntaalla popolazione normale neutrofili alta densità (HDN), in pazienti affetti da cancro, in topi portatori di tumore, come pure in condizioni infiammatorie croniche, popolazioni neutrofili bassa densità distinti (LDN) appaiono nella circolazione. LDN co-purificare con la frazione mononucleare e può essere separato dalle cellule mononucleari utilizzando sia strategie di selezione positiva o negativa. Una volta che la purezza dei neutrofili isolati è determinata mediante citometria di flusso, possono essere utilizzati per in vitro e in vivo saggi funzionali. Descriviamo tecniche per il monitoraggio dell'attività antitumorale di neutrofili, la loro capacità di migrare e per produrre specie di ossigeno reattive, così come il controllo della loro capacità fagocitica ex vivo. Descriviamo ulteriormente le tecniche per etichettare i neutrofili per il monitoraggio in vivo, e di determinare la loro capacità anti-metastatica in vivo. Tutte queste tecniche sono essenziali per capire come ottenere e caratterizzare neutrofili con antitumoralefunzione.

Introduction

I neutrofili sono stati inizialmente caratterizzati come le cellule immunitarie innate che servono come prima linea di difesa contro i microrganismi invasori. Oggi è noto che i neutrofili hanno più funzioni di vasta portata, essere coinvolti in montaggio le risposte immunitarie adattive contro antigeni estranei ^1,2, regolando emopoiesi ^3, l'angiogenesi e la guarigione delle ferite ^{4 5.} Inoltre, i neutrofili possono influenzare la crescita tumorale e nella progressione metastatica in virtù delle loro pro e anti-tumorali attività ^6,7. I neutrofili sono caratterizzati da un nucleo segmentato polimorfico (quindi definito polimorfonucleati (PMN) leucociti) e contenere almeno tre sottoclassi distinte di granuli e vescicole secretorie ⁸ (Figura 1A-C).

I neutrofili possiedono elevata capacità fagocitica e alta NADPH ossidasi critico per l'eliminazione microbica, e secernono una vasta gamma di chemochine importanti da untrazione dei neutrofili supplementari e di altre cellule immunitarie al sito di infiammazione ^8,9. I neutrofili si caratterizzano per l'espressione di una grande quantità di recettori di superficie, tra cui i recettori Toll-like (TLR), C-type lectina recettori (CLR), completano il recettore 3 (CD11b / CD18) e altre molecole di adesione (per esempio, L-selectina, LFA-1, VLA-4 e Carcinoembrionario legati molecola di adesione delle cellule 3 (CEACAM3 / CD66b)), recettori per chemochine (ad esempio, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), i recettori chemotattiche (ad esempio, PAFR, LTB ₄ R e C5aR) , i recettori delle citochine (ad esempio, G-Cecoslovacchia, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-peptidi recettori (ad esempio, FPR1-3) e recettori Fc (ad esempio, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII) e CD64 (FcγRI) ^10. Nei topi, i neutrofili sono solitamente identificati come CD11b ⁺ Ly6G ^+, mentre neutrofili umani vengono identificati utilizzando i marcatori di leucociti CD11b, CD15, CD16 e CD66b. Inoltre, è generalmente accettato di macchia per il proteine ​​granuli mieloperossidasi (MPO) e neutrofila (NE) per la rilevazione dei neutrofili nei tessuti.

Non è ancora chiaro se le diverse funzioni dei neutrofili sono mediate dalla stessa cellula o di cellule distinte sottopopolazioni. Dati accumulando suggeriscono la presenza di una popolazione eterogenea neutrofili che presenta un elevato grado di plasticità colpiti da stimoli pro-infiammatori e il microambiente ^11,12. Fridlender et al. ¹³ hanno grossolanamente diviso i neutrofili nel cancro in due grandi sotto-popolazioni chiamato N1 con proprietà anti-tumorali e N2 con proprietà pro-tumorali. Nel cancro, nonché in infiammazione cronica, vi è una sotto-popolazione supplementare composto di cellule mieloidi granulocitari derivate soppressori (G-MDSCs) che sopprimono le risposte delle cellule T ^14. G-MDSCs sono considerati cellule mieloidi immature caratterizzate da un CD11b ⁺ Ly6C^basso Ly6G fenotipo ^hi nei topi ^15, pur avendo una CD15 ⁺ / CD16 ^basso fenotipo in umano ^16. G-MDSCs esprimono alti livelli di arginasi e mieloperossidasi, mentre bassi livelli di citochine e chemochine che normali neutrofili circolanti. Sono meno fagociti e migratoria, ma producono alti livelli di ROS ^15,17,18. Nel presente lavoro descriveremo alcune metodologie di base per l'isolamento e la caratterizzazione dei neutrofili con proprietà antitumorali.

Mentre neutrofili costituiscono la più grande popolazione di tutte le cellule bianche del sangue nella circolazione umana (45 – 70%; 1.800 – 6.000 / ml), nei topi, in condizioni normali, sono piuttosto scarse (10 – 15%; 300-500 / ml ). La conta dei neutrofili aumenta costantemente su infiammazione e, occasionalmente, nel cancro, che rappresenta uno stato di infiammazione cronica ^7. I neutrofili si sviluppano da multipotenti precursore mieloide comune (CMP) cells nel midollo osseo, attraverso un processo di differenziazione che passano le fasi di mieloblasti (MB), promielociti (PM), mielociti (MC), metamielociti (MM) e cellule della band (BC) ^8. I maturi, neutrofili post-mitotico possono rimanere all'interno del midollo osseo per 4-7 giorni prima di essere rilasciati alla circolazione ^8. Fatturato dei neutrofili nel sangue è di solito rapido con una emivita media di 6-12 ore, che può essere prolungata in condizioni infiammatorie. Neutrofili non stimolate hanno limitato l'attività anti-cancerogena, una caratteristica che può essere acquisita esponendo i neutrofili naïve alle chemochine IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 e CXCL5 ^6,19 o artificialmente, esponendoli a estere phorbol phorbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) ^6.

La breve emivita di neutrofili nel sangue insieme con il basso numero di neutrofili (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ ottenuto da 1 ml di sangue di un ingenuo 6-8 settimane di età del mouse, l'hanno fattadifficile da esplorare la funzione di far circolare il mouse neutrofili in vitro. Per superare questa difficoltà, sono state utilizzate altre fonti. Per esempio, un gran numero di neutrofili possono essere ottenute dal midollo osseo ²⁰ o il peritoneo dopo l'induzione dell'infiammazione sterile (ad esempio, dopo l'iniezione intraperitoneale di tioglicolato brodo o Zymosan A). Va notato che i neutrofili ottenuti dalla cavità peritoneale non esercitano alcuna attività anti-cancerogena (osservazioni non pubblicate).

. Granot et al ⁶ osservato che i topi BALB / c inoculati ortotopicamente con il mouse 4T1 seno linea cellulare di carcinoma sviluppare neutrofilia che aggrava con progressione tumorale ⁶ (Figura 2A), tale che 20-40.000.000 neutrofili sangue possono essere facilmente isolati da 1 ml di sangue 3 – 4 settimane dopo l'inoculazione del tumore. Questi neutrofili hanno acquisito le attività anti-tumorali, e di conseguenza sono stati coineutrofili ned tumorali trascinato (TEN), al fine di distinguerli dai neutrofili naïve ⁶ (Figura 2B). Mentre neutrofili alta densità (HDN, Figura 1A) sono altamente anti-oncogeno, neutrofili a bassa densità (LDN, Figura 1B) generate nel contesto di cancro non sono ^21. Inoltre, i neutrofili ad alta densità del midollo osseo e milza di topi portatori di tumore hanno attività anti-tumorale (dati non pubblicati). Va notato che, con progressione tumorale milza diventa gradualmente (splenomegalia), con quantità crescenti di neutrofili.

Va notato che TEN vengono generati anche in altri modelli di cancro inclusi sia spontanei (MMTV-PyMT e MMTV-Wnt1 tumori mammari e k-Ras tumori polmonari motrice) e iniettato (AT-3 (MMTV-PyMT) e carcinoma mammario E0771 cellule, LLC Lewis cellule di carcinoma del polmone e cellule B16-F10 melanoma). Tuttavia, la misura di neutrofili mobilitazione in questi tumo modelli è molto meno di topi 4T1-inoculati, raggiungendo 5 – 10 x 10 ⁶ neutrofili in 1 ml di sangue dopo 3 settimane.

Protocol

Animali: 5-7 settimane BALB / c topi sono acquistati da Harlan (Israele). Tutti gli esperimenti su animali sono stati approvati dalla Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali della Hebrew University (IACUC). Campioni umani: Raccolta di sangue da pazienti oncologici e volontari sani è stato approvato dal Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB). 1. Induzione di neutrofili con proprietà anti-tumorali in vivo, utilizzando un modello murino del cancro della mammel…

Representative Results

In un recente studio abbiamo identificato una funzione anti-metastatico per i neutrofili 6. I neutrofili da topi portatori di tumore acquisire un fenotipo citotossico e hanno la capacità di uccidere le cellule tumorali 6. Questo è in contrasto con neutrofili da topi naive che non hanno alcun significativo effetto antitumorale 6. Molte delle tecniche descritte nella sezione protocollo sono stati utilizzati per studiare la funzione dei neutrofili antitumorale in vitro e in v…

Discussion

I neutrofili sono la più abbondante di tutte le cellule bianche del sangue e sono i primi interventi in caso di infezioni e infiammazioni. Come tali, essi sono molto sensibili a segnali esterni e sono facilmente attivati. Inoltre, i neutrofili hanno una breve emivita e un rapido turnover. Insieme, queste caratteristiche sollevano varie difficoltà nel lavorare con neutrofili, tale che sono richieste uniche strategie sperimentali. Per esempio, ci sono diverse strategie di purificazione dei neutrofili, ognuno con i suoi …

Materials

CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Sterile
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Sterile
Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Sterile
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Sterile
20G 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Sterile
23G 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Sterile
25Gx5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Sterile
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Sterile
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Sterile
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Sterile
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Sterile
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Sterile
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Sterile
Penicillin Streptomycin x1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Sterile
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Sterile
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution	Sigma	MHS-32
PBS+0.5% BSA			Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS+1% BSA			Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA			Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water                     and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3)			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl)			Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution			Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution			Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide			Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution			Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Resuspend 1 mg Zymosan A  in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube.                            Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave.            Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE selection cocktail	STEMCELL Technologies	18151
the EasySep magnetic nanoparticles	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU flow kit	BD Pharmingen	559619
MACS Neutrophil isolation kit	Miltenyi Biotec	130-097-658
Phagocytosis Assay Kit	Cayman Chemical Company	500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody	Biolegend	101302
Purified rat anti-Ly6G antibody	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11