抗腫瘍特性を有する好中球の単離とキャラクタリゼーション
Summary
Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.
Abstract
好中球は、ヒト循環中の全白血球の最も豊富な、微生物侵入に対する宿主防御において重要な役割を果たしています。さらに、好中球は、腫瘍細胞の免疫監視において中心的な役割を果たす。彼らは、腫瘍細胞を認識し、細胞接触依存性機構含む過酸化水素を介して、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を介してのいずれかで腫瘍細胞死を誘導する能力を有します。抗腫瘍活性を有する好中球は、癌患者の腫瘍を有するマウスの末梢血から単離することができます。これらの好中球は、有意な腫瘍細胞傷害活性を示さない健常者またはナイーブマウスの好中球と区別するために、腫瘍同伴好中球（TEN）と呼ばれています。他の白血球と比較して、好中球は、密度勾配にかけたときに可能> 98％純粋な好中球の集団を得ることができる別の浮力を示しています。しかし、加えて、通常高密度の好中球集団（HDN）に、癌患者において、腫瘍を有するマウスにおける、ならびに慢性炎症性条件下で、明確な低密度好中球集団（LDN）は、循環に表示されます。 LDNは、単核画分と共精製すると、正または負の選択戦略を用いて、単核細胞から分離することができます。単離された好中球の純度は、フローサイトメトリーにより決定されると、それらは、 インビトロおよびインビボ機能アッセイにおいて用いることができます。我々は、好中球の抗腫瘍活性を監視するための能力移行すると活性酸素種を生成すること、ならびにそれらの貪食能のex vivoでモニタリングする技術を説明します。我々はさらに、in vivoで追跡するための好中球を標識するための技術を説明し、そしてインビボでの抗転移能力を決定します。すべてのこれらの技術は、抗腫瘍で好中球を取得し、特徴づけるためにどのように理解するために不可欠です機能。
Introduction
好中球は、最初に侵入微生物に対する最初の行の防御として機能する自然免疫細胞として特徴づけられました。今日では、好中球は造血3の調節、外来抗原1,2-に対する適応免疫応答をマウントに関与している多くの広範囲の機能を有することが知られている血管新生4,5創傷治癒します。さらに、好中球は、それらのプロ及び抗腫瘍活性6,7によって腫瘍の増殖および転移の進行に影響を及ぼし得ます。好中球は、多型、セグメント化、核によって特徴付けられる（したがって、多形核（PMN）白血球と呼ばれる）と、少なくとも3顆粒の別個のサブクラスならびに分泌小胞8（ 図1A-C）を含有します。
好中球は、高い貪食能と微生物の除去のための重要な高NADPHオキシダーゼ活性を有しており、時のための重要なケモカインの広い範囲を分泌します炎症8,9の部位に付加的な好中球および他の免疫細胞の牽引。好中球は、Toll様受容体（TLR）を含む表面受容体の多量の発現を特徴とする、C型レクチン受容体（のCLR）は、受容体3（のCD11b / CD18）、および他の接着分子（ 例えば、L-セレクチンを補完しますLFA-1、VLA-4および癌胎児性抗原関連細胞接着分子3（CEACAM3 / CD66b））、ケモカイン受容体（ 例えば、CXCR1、CXCR2、CCR1、CCR2）、化学誘引物質受容体（ 例えば、PAFR、LTB 4 RとのC5aR） 、サイトカイン受容体（ 例えば、G-CSFR、IL-1R、IL-4R、IL-12R、IL-18R、TNFR）、ホルミルペプチド受容体（ 例えば、FPR1-3）、およびFc受容体（ 例えば、CD16（FcγRIIIをヒト好中球はのCD11b、CD15、CD16およびCD66b白血球マーカーを用いて同定されるのに対して）、CD32（のFcγRII）およびCD64（FcγRIで）10。マウスでは、好中球は通常、のCD11b + Ly6G +として同定されています。また、一般的に組織中の好中球の検出のための顆粒タンパク質のミエロペルオキシダーゼ（MPO）と好中球エラスターゼ（NE）のために染色する受け入れられています。
これは、好中球の多様な機能が同じ細胞により、または異なる細胞亜集団によって媒介されるかどうかはまだ不明です。蓄積データは、プロ炎症性刺激と微小環境11,12の影響を受けて可塑性の高度を示す異種好中球集団の存在を示唆しています。 Fridlender ら 13は、2つの主要な亜集団に癌において好中球を著しく分割しているプロ腫瘍特性を有する抗腫瘍特性を有するN1およびN2と呼ばれます。癌において、ならびに慢性炎症において、T細胞応答14を抑制顆粒骨髄由来サプレッサー細胞（G-たMDSC）からなる追加の亜集団が存在します。 G-のMDSCはのCD11b + Ly6Cによって特徴付け未熟骨髄細胞であると考えられていますマウス15で低 Ly6G こんにちは表現型、ヒト16でCD15 + / CD16 低の表現型を有しながら。 G-たMDSC通常よりもサイトカインおよびケモカインのより低いレベルは、好中球を循環させながら、アルギナーゼおよびミエロペルオキシダーゼのより高いレベルを発現します。彼らはあまり食作用および移動であるが、ROS 15,17,18の高いレベルを生成します。本論文では、抗腫瘍特性を有する好中球の単離および特徴付けのためにいくつかの基本的な方法論を説明します。
（45から70までパーセント; 1,800 – 6,000 /μl）を好中球は、ヒトの循環内のすべての白血球の最大の人口を構成しているが、マウスでは、通常の条件下で、彼らは（10むしろ疎である – 15％、300から500 /μL ）。慢性炎症7の状態を示して着実に炎症時に時折癌における好中球数が増加します。好中球は多能骨髄系共通前駆体（CMP）CEから発生します骨髄中のLLS、骨髄芽球の段階を通過する分化プロセス（MB）を介して、前骨髄球（PM）、骨髄球（MC）、後骨髄球（MM）とバンド細胞（BC）8。それらは循環8に放出される前に7日-成熟した、有糸分裂後の好中球は4のための骨髄内に残ることがあります。炎症状態の下で延長することができる12時間、 – 血液中の好中球の売上高は6の平均半減期は、通常、迅速です。非刺激好中球は、ホルボールエステルホルボール12にそれらを暴露することにより、抗腫瘍形成活性、ケモカインIL-8（CXCL2）、CCL2、CCL5およびCXCL5 6,19または人工的にナイーブな好中球を露出することによって取得することができる機能を制限してきました-myristate 13-アセテート（PMA）6。
一緒に好中球の数が少ないと血液の好中球の半減期が短い（〜3から5×10 5）ナイーブ6 1mlの血液から達成- 8週齢のマウス、それを作りましたin vitroでマウスの好中球を循環させる機能を探索することは困難。この困難を克服するために、他のソースが使用されています。例えば、好中球の多くは、（チオグリコレート培地またはザイモサンAの腹腔内注射後に、 例えば ）骨髄20または無菌性炎症の誘導後腹膜から得ることができます。これは、腹腔から得られた好中球は、任意の抗腫瘍形成活性（未発表の観察）を及ぼさないことに留意すべきです。
Granot ら 6 20れるよう、マウス4T1乳癌細胞株を用いて同所接種したBALB / cマウスは、腫瘍進行6（ 図2A）で悪化好中球増加症を発症することが観察- 40万人の血液好中球は容易に1ミリリットルの血液から単離することができます3から4週間後、腫瘍接種。これらの好中球は、抗腫瘍活性を獲得し、それに応じてCOIされていますナイーブ好中球6（ 図2B）と区別するために定義される腫瘍連行好中球（TEN）、。高密度の好中球（HDN、 図1（a））は非常に抗腫瘍形成であるが、癌との関連で発生した低密度の好中球（LDN、 図1B）は 21ではありません。また、腫瘍を有するマウスの骨髄および脾臓から高密度の好中球は、抗腫瘍活性（未発表データ）を有しています。これは、好中球の量が増加すると、腫瘍の進行に脾臓を徐々に拡大（脾腫）となることに留意すべきです。
これは、10にも自発的な（MMTV-PyMTおよびMMTV-Wnt1の乳腺腫瘍とのK-ras駆動肺腫瘍）の両方を含む癌の他のモデルで生成され、AT-3（MMTV-PyMT）とE0771の乳癌（注入されることに留意すべきです細胞、LLCルイス肺癌細胞およびB16-F10黒色腫細胞）。しかしながら、これらのTUMでの好中球動員の、程度3週間後に1ミリリットルの血液中の10×10 6好中球-またはモデルが5に達し、4T1-接種されたマウスのよりもはるかに少ないです。
Protocol
Representative Results
Discussion
好中球は、すべての白血球の最も豊富であり、感染症や炎症の場合には最初の対応です。そのようなものとして、それらは、外部の合図に非常に敏感であり、容易に活性化されます。また、好中球は非常に短い半減期および迅速なターンオーバーを持っています。一緒に、これらの特性は、ユニークな実験的な戦略が必要とされるように、好中球での作業のいくつかの困難を、上げます。例?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ZGはイスラエル科学財団（助成金番号11分の41）のI-COREプログラムからの助成金によってサポートされ、Abisch·フレンケル財団、Rosetrees信託、イスラエル癌研究財団（ICRF – 研究キャリア開発賞）とCONCERNファンデーション。 ZGFはイスラエル癌研究財団（ICRF – 研究キャリア開発賞）からの助成金によってサポートされ、保健のイスラエル省イスラエル肺協会のチーフサイエンティスト。
Materials
| CELL LINES | |||
| Mouse 4T1 breast carcinoma cells | ADCC | CRL-2539 | Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS |
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| 24-well Tissue Culture Plate | Falcon | 353047 | Sterile |
| 100 mm Tissue Culture Plate | Corning | 430167 | Sterile |
| 25 cm2 Tissue Culture Flask | Nunc | 156340 | Sterile |
| 90 mm Bacterial Grade Culture Dish | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 20090-01-017 | Sterile |
| 15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835015-40-111 | Sterile |
| 50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835050-21-111 | Sterile |
| Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube | Becton Dickinson | 352058 | Sterile |
| Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm | Merck Millipore | PSMT010R1 | Sterile |
| White 96-Flat-Bottom Well Plate | Costar | 3917 | Sterile |
| Cell Strainer (40 mm) | BD Falcon | 352340 | Sterile |
| 20G 1.5" Needle | BD Microlance 3 | 301300 | Sterile |
| 23G 1" Needle | BD Microlance 4 | 300800 | Sterile |
| 25Gx5/8" Needle | BD Microlance 5 | 300600 | Sterile |
| 0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle | BD Micro-Fine Plus Demi | 320829 | Sterile |
| 9 mm Clips | BD, AutoClip | 427631 | Sterile |
| EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | Sterile |
| MidiMACS Separator Magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Microscope Glass Slide | Menzel-Gläser Superfrost Plus Thermo | J1800AMNZ | |
| Orbital Shaker | Sky line, ELMI | S-3.02.10L | |
| Plate Reader | TECAN | InfiniteF200Pro | |
| POWDER | |||
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Sigma | A7906 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | BD Pharmingen | 550891 | Sterile |
| CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) | Molecular Probes | C1157 | |
| Dextran T500 | Sigma | 31392 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma | S8032 | Highly toxic, handle with care |
| Thioglycollate powder | Difco | 225650 | |
| Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Sigma | D5796 | Sterile |
| Opti-MEM® I reduced serum medium | Life Technologies | 31985062 | Sterile |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | Sterile |
| Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated | Sigma | F9665 | Sterile |
| L-Glutamine | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-020-1A | Sterile |
| Sodium pyruvate | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-042-1B | Sterile |
| Penicillin Streptomycin x1000 solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-031-5 | Sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-1 | Sterile |
| PBSx10 without Ca2+ and Mg2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-5A | Sterile |
| HPLC grade water | J.T. Baker | 4218-03 | Autoclave |
| SOLUTIONS | |||
| ACK – Ammonium-Chloride-Potassium | Life Technologies | A10492-01 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS | Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter. | ||
| CFSE, 5 mM in DMSO | Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC. | ||
| Eosin Y solution | Sigma | HT110-2-32 | |
| Hanks' balanced salt solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Heparin, 20 mg/ml in PBS | Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| Histopaque-1119 | Sigma | 11191 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
| Luciferase cell culture lysis buffer x5 | Promega | E153A | Dilute 1:5 in sterile water just before use. |
| Luciferase assay solution | Promega | E1501 | Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A) |
| Mayer's Hematoxylin solution | Sigma | MHS-32 | |
| PBS+0.5% BSA | Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| PBS+1% BSA | Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| 5x PBS with 2.5% BSA | Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| Saline (0.9% NaCl) | Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
| 0.2% NaCl solution | Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
| 1.6% NaCl solution | Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
| 2 % Sodium azide | Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic. | ||
| 3% Thioglycollate solution | Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw. Boil until solution becomes yellow and autoclave. | ||
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution. |
| Trypsin solution B | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-046-1 | Sterile |
| 1 mg/ml Zymosan A | Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use. | ||
| KITS | |||
| EasySep PE selection kit | STEMCELL Technologies | 18557 | |
| EasySep PE selection cocktail | STEMCELL Technologies | 18151 | |
| the EasySep magnetic nanoparticles | STEMCELL Technologies | 18150 | |
| Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19762 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19257 | |
| FITC BrdU flow kit | BD Pharmingen | 559619 | |
| MACS Neutrophil isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
| Phagocytosis Assay Kit | Cayman Chemical Company | 500290 | |
| ANTIBODIES | |||
| FcR blocking antibody | Biolegend | 101302 | |
| Purified rat anti-Ly6G antibody | BD Pharmingen | 551459 | Clone 1A8 |
| PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody | Biolegend | 127608 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G | BD Pharmingen | 551460 | Clone 1A8 |
| PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 65-1276 | Clone 1A8 |
| violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 75-1276 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b | BD Pharmingen | 553310 | Clone M1/70 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen | 553127 | Clone RB6-8C5 |
| PE-conjugated rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 553081 | Clone 30-F11 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80 | Abcam | ab60343 | Clone BM8 |
| FITC-conjugated mouse anti-human CD66b | Biolegend | 305103 | Clone G10F5 |
| Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k) | BD Pharmingen | 553927 | Clone R35-95 |
| LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11 |
Riferimenti
- Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
- Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
- Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
- Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
- Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
- Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: ‘N1’ versus ‘N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
- Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
- Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
- Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
- Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
- Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).
