Visualisering av chondrocyttransplantasjon innskyting og Directional spredning via Zebrabow Klonal Cell Analysis i Embryonic Meckels Brusk

Summary

Cell organisering av kraniofaciale bein har lenge vært en teori, men aldri direkte visualisert. Multispektral celle merking og in vivo levende bildebehandling tillater visualisering av dynamisk celle atferd i sebrafisk underkjeven. Her, til vi detalj protokollen manipulere Zebrabow transgen fisk og direkte observere celle innskyting og morfologiske endringer av chondrocytes i Meckels brusk.

Abstract

Utvikling av virveldyr kraniofaciale strukturer krever nøyaktig koordinering av celle migrasjon, spredning, heft og differensiering. Mønstring av Meckels brusk, en første svelget bue derivat, innebærer migrasjon av kranie neural crest (CNC) celler og progressive partisjonering, spredning og organisering av differensierte chondrocytes. Flere studier har beskrevet CNC migrasjon under underkjeven morphogenesis, men detaljene om hvordan kondrocyttene oppnå organisasjon i vekst og utvidelse av Meckels brusk er fortsatt uklart. Den sox10 begrenset og kjemisk indusert Cre rekombinase-mediert rekombinasjon genererer permutasjoner av ulike fluorescerende proteiner (RFP, YFP og CFP), og dermed skape en multi-spektral merking av stamceller og deres avkom, som gjenspeiler forskjellige klonale populasjoner. Ved hjelp av konfokal time-lapse fotografering, er det mulig å observere chondrocytes behavieller under utviklingen av sebrafisk Meckels brusk.

Multispektrale celle merking gjør det mulig for forskere å demonstrere forlengelse av Meckels chondrocytter. I forlengelse av Meckels brusk, som et forvarsel om kjeven, chondrocytes intercalate å gjennomføre utvidelsen som de stakk i en organisert encellede lagdelte rad. Unnlatelse av dette organisert interkalerende prosess for å megle celle forlengelse gir mobil mekanistisk forklaring for hypoplastisk kjeven at vi observerer i underkjevens misdannelser.

Introduction

Kraniofaciale utvikling krever kompliserte molekylære, cellulære og vev interaksjoner å kjøre celleproliferasjon, migrasjon og differensiering ^{1,2, 3.} Denne tett regulert og komplisert prosess er gjenstand for genetiske og miljømessige forstyrrelser, slik at kraniofaciale misdannelser er blant de vanligste medfødte misdannelser ^1-9. Mens kirurgiske inngrep forbli bærebjelke i behandling for kraniofaciale anomalier, forstå utviklingen basis er avgjørende for å skape fremtidige terapier. Derfor studerer morphogenesis og mekanismene i konvergens og forlengelse og celle integrasjon gir ny innsikt i dannelsen av det kraniofaciale skjelettet ^1.

Kranie neural crest migrere og fylle den første svelg bue, deretter danne sammenkoblede underkjevens prosesser som strekker seg for å danne Meckels brusk, som et forvarsel om kjeven. Morphogenesis of Meckels brusk krever kondrocytt organisasjon via retnings spredning, celle polarisering og differensiering ^1,10. Men intricacy av kondrocytt organisasjon i vekst og utvidelse av Meckels brusk er fortsatt uklart. Forstå dynamisk celle atferd er avgjørende for å forstå medfødte misdannelser som påvirker mandibular størrelse, for eksempel hypoplastisk kjeven fenotyper ^11.

Sebrafisk embryo tilbyr mange utviklings og genetiske fordeler for detaljert studie av Meckels brusk morphogenesis. Deres genetiske tractability, åpenhet, ex vivo og rask utvikling er kraftige fordeler utlån det godt for observasjon av celle bevegelse og organisering av levende avbildning ^6. Bruke avstamning-sporing verktøy, for eksempel sox10: kaede transgen linje, har vi og andre avgrenset neural crest opprinnelsen til embryonale kraniofaciale skjelettet ^1,5. USIng sox10: ERT2-Cre med Ubi: Zebrabow-M transgen linje, er det nå mulig å utforske detaljer om cellulære bevegelser under kraniofaciale utvikling. Den Zebrabow-M, er en transgen linje konstruert med ubiquitin promoter driver uttrykk for forskjellige fluorophores, hver flankert av Lox nettsider ^8. Den Zebrabow-M standard fluorophore er Red, uttrykker RFP. Etter induksjon av Cre uttrykk, Zebrabow-M konstruere recombines og celler uttrykker en kombinasjon av ulike fluoroforer (RFP, CFP og YFP) skaper multispektrale uttrykk i embryoet. Alle dattercellene som deler fra de merkede cellene etter rekombinasjon arrangementet blir så clonally merket, slik at cellepopulasjoner som stammer fra ulike sidestilte stamfedre er clonally merket. Ved denne celle kloning merking, kan cellene proliferasjon og migrering med klonal oppløsning følges (figur 1 og 2).

Protocol

Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjent alle prosedyrer i henhold til protokoll nummer # 2010N000106. Dette er i samsvar med Foreningen for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) retningslinjer. 1. Reagenser og materialer Forberedelse Forbered 1 liter 50X E3 embryo medium (se tabell 1), og fremstille en liter 1X E3 embryo medium (se tabell <…

Representative Results

Tradisjonell brusk visualisering av hele mount Alcian blå flekker har vært uvurderlig i å observere utviklingen Meckels brusk og vanligvis brukes til å visualisere slutt cellular organisasjon 12 (figur 1A). For ytterligere å analysere utviklings chondrocytes overtid, avstamning sporing ved hjelp sox10: Kaede transgene linjer har gitt oss mulighet til å studere cellemigrasjon, konvergens og forlengelse i levende embryoer 2,12 (Figur 1b). Men fortsatt …

Discussion

Alcian blått og photoconvertible transgene linjer som beskrevet ovenfor utfyller hverandre for å definere innviklet prosess av brusk og bein utvikling. Imidlertid har levende cellemigrasjon og organisasjon under organ lenge vært en teori og indirekte demonstrert men aldri visualisert. Zebrabow-M transgen linje kombinert med en brusk bestemt Cre tillater samtidig levende observasjon av alle disse forskjellige arrangementer som er involvert i bein og brusk formasjon. Denne teknikken gjør det mulig å studere nedre kje…

Materials

Pronase	Roche Life Sciences	10165921001	Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0262
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7619
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
4-HydoxyTamoxifen	Sigma-Aldrich	T176
24 x 60 coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
18 x 18 coverslips	Fisher Scientific	12-540A
25 x 25 coverslips	Fisher Scientific	12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit	Life technologies	K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Life Technologies	K2400-20
pENTR3'-pA	Tol2Kit	302
pDEST			Gift from Geoffrey Burns labs
Equipments
Bright field microscope
Fluorescent microscope
Confocal microscope
Image processing software