The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.
Sebrafisk har dukket opp som en verdifull genetisk modellsystem for studier av utviklingsbiologi og sykdom. Sebrafisk deler en høy grad av genomisk konservering, så vel som likheter i cellulære, molekylære og fysiologiske prosesser, med andre virveldyr, inkludert mennesker. Under tidlig ontogeny, sebrafisk embryo er optisk transparent, slik at forskerne å visualisere dynamikken i organ hjelp av et enkelt stereomikroskop. Mikro implantasjon er en metode som gjør det mulig vev manipulasjon gjennom endring av faktorene i lokale miljøer. Dette gjør det mulig for forskere å analysere effektene av hvilket som helst antall signalmolekyler av interesse, slik som utskilles peptider, på bestemte romlige og tidsmessige punkter innenfor utvikling av embryo. Her har vi detalj en protokoll for å manipulere og implantat perler under tidlig sebrafisk utvikling.
Utviklingsbiologi forskerne utnytte en lang rekke cellulære, molekylære og genetiske metoder for å avdekke de mekanismene som styrer hvordan en organisme er dannet. Blant disse metodene, er vev manipulasjon et viktig verktøy i å tyde komplekse spørsmål om celle skjebne, cellulær bevegelse, og organisering av vev. En måte å endre de lokale vev miljøer er gjennom den kirurgiske anvendelsen av mikroperler som brukes til å levere en fokal kilde for proteiner eller andre signalmolekyler 1. Denne type av eksperimentell manipulasjon har vært mye implementert i klassiske virveldyr embryologi modeller, slik som frosk og chick 2.
Sebrafisk er blitt et viktig virveldyr modellorganisme for studier av organ og gir også mange unike fordeler for sykdom modellering 3-5 som de deler med høy genetisk bevaring med mennesker 6. Spesielt, den optiske gjennomsiktighet og exintern utvikling av sebrafisk embryo tilbyr en uovertruffen synspunkt for observasjon av vev ontogeny 3-5. Gjennomføringen av store termin genetiske skjermer har generert en kraftig oppbevaringssted for sebrafisk mutantstammer for videre studier 7,8, og identifisering av alternative screeningteknikker som kan effektivt gjennomført med redusert skala i enkle laboratorier 9,10. Videre eksperimentelt arbeid med sebrafisk har blitt tilrettelagt gjennom fremskritt i transgene metoder og reversere genetiske tilnærminger 11,12, samt kjemiske genetikk 13-15.
Tissue manipulasjonsteknikker, slik som innføringen av mikroperler, ikke vært så vidt anvendt i sebrafisk, men likevel gi et nyttig verktøy for ytterligere å forstå cellesignalisering i løpet av utviklingen. Mikroperler implantasjon har blitt brukt til å avhøre prosesser av organdannelse i sebrafisk retina16,17, hjerte 18, hjerne 19-22, neural crest 23, og fin 24,25. I disse og andre studier har perlene er anvendt under utvikling for å forstå spredning av signalmolekyler 26, hvor gradienter påvirker cellemigrering 27 og 28 aksialt mønster. Mer nylig, har mikroperlene blitt benyttet for å evaluere restitusjon mekanismer i voksne sebrafisk 29. I utviklingsstudier, for eksempel, har sebrafisk mikro arbeid gitt innsikt i mekanismene for lem dannelse gjennom studier av brystfinnen 25. Sebrafisk brystfinnen bud er homolog med forbena knopp i muse 30 og dama 31. Virveldyr lem knopp har to viktige signal noder: sonen av polariserende aktivitet (ZPA) som etablerer anterior-til-posterior aksen gjennom uttrykket av Sonic pinnsvin (Shh) og nedstrøms Hox-gen mål,og den apikale ectodermal ryggen (AER) til stede på tuppen av greinen knopp, som virker å etablere proksimale til distale identitet lem gjennom uttrykk for fibroblastvekstfaktorer (FGF'er). Ved å implantere FGF dynket microbeads i sebrafisk Shh genetiske mutanter, etterforskere identifisert FGF som avgjørende for utviklingen av cellesyklusen og vekst av virveldyr lem 25. I tillegg til den FGF og Shh signaliserer kaskader som etablerer posisjons identitet, banebrytende studier med dama lem bud identifisert retinsyre (RA) som et molekyl som kan etterligne virkningen av polariserende region å etablere anterior til bakre identitet 32. Disse eksperimentene er involvert plassere små strimler av RA-gjennomvåt Whatman papir i chick lem å vurdere sifret mønster 32. Videre har forskere utført på andre elegante studier som anvender bruk av mikroperler, celletransplantasjon, og eksogenRA behandlinger i sebrafisk for å fastslå at RA fungerer for å gi langtrekkende posisjon signaler i sebrafisk hindbrain og mesoderm 28. Men i dag mange spørsmål gjenstår om rollene som signaliserte faktorer som FGF og RA i mange aspekter av virveldyr utvikling. Signaleringseffekter av RA, fungerer som en morphogen, påvirker mange organer 33, som for eksempel å utvikle hjerte 34 og nyrestamfedre, der RA spesifiserer proksimale nyreceller skriver skjebner 35-39. Videre forståelse av slike emner kan ha stor nytte av eksperimentelle studier med vev manipulasjon og mikro implantasjonsteknikk.
Mens færre studier har blitt utført med mikro implantasjon i sebrafisk, i forhold til modeller som chick, har de som har blitt gjennomført vært svært informativ. En årsak til det sparsommelige mikroperlens implantasjon basert-forskning i sebrafisk embryo er likely forestillingen om at det er vanskelige tekniske utfordringer, basert på størrelsen av embryoet, som utgjør et hinder for å kunne utføre slike manipulasjoner. Imidlertid kan mikro implantering i sebrafisk embryo læres med praksis og assistert gjennom visuell observasjon av teknikken, og dermed kan bli ivaretatt som et middel til å avhøre mekanismene for utvikling. Her viser vi nøyaktig påføring av et mikroperler inn i sebrafisk embryo, noe som kan benyttes for gjennomføring av en lang rekke analyser på vev og celledannelse morfogenese.
I løpet av det siste århundret, har forståelsen av kroppen plan mønster og organogenesen gått monumentale fremskritt. Vev manipulasjonsteknikker var kritisk i avdekke nøkkelinformasjon om disse vitale prosesser. Genetisk modifikasjon er en av de mest brukte metoder for å fastslå genfunksjon, og fremgangsmåter for mosaikk analyse, slik som celletransplantasjon, gi nyttige metoder for å forstå autonomi av genfunksjon. Mikro implantasjon gir en annen arena å avhøre hvordan bestemte molekyler endre dynamikken utviklings, da denne metoden gjør det mulig for forskeren å endre en lokal vev miljø ved å innføre signalmolekyler eller hemmere. En rekke forskjellige mikro er kommersielt tilgjengelige, som har varierende størrelse og andre fysiske egenskaper finnes (for eksempel ladning), slik at de kan anvendes til de forsøksbetingelser av interesse. Således, ved å implantere mikroperler som er fuktet i et protein eller kjemical av interesse i en organisme, kan forskere undersøke lokaliserte effekter under utvikling og finne assosiasjoner mellom genet eller molekylet av interesse, og spesielt biologisk fenotype (r).
Studier som en utført av Wada og kolleger brukte mikro implantasjon for å vurdere effekten av økt Hedgehog signalisering i skjelett mønster i fremre neurocranium (ANC) i sebrafisk 23. Tidligere studier har vist at Shh er nødvendig for ANC formasjonen 14. Identifiseres ved hjelp Hysj-belagt mikro forskere at dette signalet fremmer bruskdannelse i ANC. Mikroperlens implantasjon prosessen ble brukt til å demonstrere en klar sammenheng mellom Hedgehog signalering og bruskdannelse i ANC. En annen viktig eksempel på dette vevet manipulasjon teknikk i sebrafisk er observert i studier der forskere undersøkt transkripsjons kontroll av Erythroblastoma tjueseks (ETS) domene fskuespillere ETS-relaterte molekyl (Erm) og Polyoma Enhancer aktivator 3 (Pea3) av FGF signale under tidlig sebrafisk hjernens utvikling 19. Gjennom mikro implantasjon eksperimenter, var de i stand til å vise at Fgf8 og Fgf3 kan ectopically aktivere uttrykk for erm og pea3. Disse eksempler illustrerer anvendeligheten av mikroperler for å gi innsikt i den utviklingsmessige mekanismer som samarbeider under dannelse vev, som kan være godt kjennetegnes ved bruk av metoder for å vurdere genekspresjon 41. Således kan mikro transplantasjon være en levedyktig metode for å utforske andre vev, slik som det mellomliggende mesoderm (IM), som gir opphav til nyrene. Spesielt ville det hjelpe til nyreutviklingsstudier, for å undersøke hvordan ulike molekyler påvirker nephron segmentering 42 og tubulogenesis 43,44, prosesser som bare overfladisk forstått i dag. Videre har mikro implantering begynt å bli brukt til study regenereringsprosesser i sebrafisk 29] og kan tilpasses for bruk med en rekke organ restitusjon modeller, for eksempel følgende laser ablasjon av embryonale vev som nephron 45 eller sammen med metoder som har blitt formulert for å utføre forskning med de tilsvarende voksne strukturer 46-49. Endelig har mikro implantasjon potensiale til å bli brukt i modeller av human sykdom, slik som kreft eller vev degenerasjon 50,51 52,53.
I den foreliggende protokoll, vi demonstrere metoden for mikro implantasjon i sebrafisk embryo, som også har blitt tilsvarende beskrevet av andre forskere, men ikke vist gjennom video protokoller 1. Med minimal praksis kunne vi implantere mikroperler på en omtrentlig hastighet på 8-10 embryo / t, noe som er relatert gjennomførbarheten av denne prosedyren når forskeren har litt erfaring. Resultatene vist heri Resultatene viser at perler av forskjellige dimensions kan implanteres på tidlige stadier, og det med omhu, kan dette vevet manipulasjon teknikk gjennomføres med minimal fysisk avbrudd i embryo. En forbedring som bør fremheves er bruk av en whisker / lash-verktøyet for å plassere mikro inn i embryo. Denne forholdsvis billig og enkelt stykke utstyr er omtrent den samme diameter som den mikroperle, er lett å få tak i og bidrar til å fremskynde prosessen implantasjon. Den whisker / vippe kan kuttes til ønsket lengde for å produsere et fast ennå delikat perle-håndtering verktøy, avhengig av forsker fingerferdighet og preferanser. Til slutt, mens vi som beskrives her hvordan du fysisk manipulere microbeads og sebrafisk embryo å utføre implantering, denne protokollen ikke skissere konkrete behandlingsprosedyrer for ulike medikamenter eller peptider. Generelt bør kjemisk behandlede mikrokuler bli implantert i dyret med hensiktsmessighet, for å unngå uønskede virkninger på andre områder i organismen, og forskere bør være godt idannet om mulige sikkerhetsproblemer forbundet med slike kjemikalier før du starter sine studier.
I sum har vi vist en relativt enkel og effektiv mikro implantasjon metode med et bredt spekter av applikasjoner ved hjelp av materialer som er lett tilgjengelig i laboratoriet. Til syvende og sist, håper vi at denne håndboken vil hjelpe forskere med delikat natur sebrafisk vev manipulasjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend DP2OD008470.
Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
HEPES | Sigma Life Science | H4034 | |
Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-20ML | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane) | Fluka Analytical | A5040 | |
Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
250mL Erlenmeyer Flask | Fischer Scientific | FB-500-250 | |
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile | Corning | 430167 | |
60mm x 15mm | VWR | 25373-085 | |
100mm x 15mm | VWR | 25373-100 | |
150mm x 15mm | VWR | 25373-187 | |
Saint-Gobain Chemware Microspatula | Fischer Scientific | 21-401-50B | |
P-1000 Micropipette tips | Fischer Scientific | 2707402 | |
Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
Dimethly Sulfoxide | American Bioanalytical | AB00435 | |
Microbeads (45-106 µm) | Biorad | 140-1454 AG1-X8 | |
Microbeads (45 µm) | Polysciences | 7314 | |
Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
Tungsten Needle | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6065 | |
Capillary tube holder | Globe Scientific Inc. | 51674 |