نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis<em> في المختبر</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
تكوين والميكانيكية خصائص المصفوفة خارج الخلية تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع الأنسجة. هذا الضام سدى النسيج التنوع إلى حد كبير سلوك الخلية الآثار لتنظيم عمليات طبيعية ومرضية بما في ذلك تكاثر الخلايا، والتمايز، التصاق الإشارات والهجرة الاتجاه. في هذا الصدد، والقدرة الفطرية لبعض أنواع الخلايا إلى الهجرة نحو أشد، أو أقل المتوافقة ويشار إلى durotaxis الركيزة المصفوفة. هذه الظاهرة تلعب دورا مهما أثناء التطور الجنيني وإصلاح الجرح وغزو الخلايا السرطانية. هنا، نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis، في المختبر، وذلك باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز. إعداد وصف durotaxis غرف يخلق واجهة صلابة بين هلام PDMS لينة نسبيا وساترة الزجاج جامدة. في المثال المقدمة، وقد استخدمنا هذه durotaxis غرف لإثبات دور للcdc42 / RAC1 GTPase تفعيل المتواجدفي، cdGAP، في mechanosensing وdurotaxis التنظيم في خلايا عظمية U2OS الإنسان. هذا الاختبار هو قابلية للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى و / أو ضربة قاضية للبروتينات أخرى من المصالح لاستكشاف دور كل منهما في mechanosignaling وdurotaxis.
Introduction
وتتألف المصفوفة خارج الخلية (ECM) من مجموعة معقدة من البروتينات الهيكلية ويشابك بما في ذلك الكولاجين، فبرونيكتين و laminin. على الرغم من أنها راسخة بأن ECM يوفر الدعم الهيكلي المهم لأنسجة الخلوية، وهناك أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا تستجيب بشكل فعال للتغيرات الفيزيائية في البيئة ECM لتنظيم العمليات الخلوية المتنوعة بما في ذلك بقاء الخلية، التمايز والهجرة الخلية. على سبيل المثال، يمكن أن الاختلافات في صلابة ECM تدفع الخلايا الجذعية الوسيطة نحو الأنساب مختلفة، مع ركائز لينة (~ 1 كيلو باسكال) تعزيز الأنساب العصبية بينما شديدة (~ 25 كيلو باسكال) ركائز تعزيز التمايز عظمي المنشأ 1. وبالمثل، قد أظهرت زيادة في صلابة انسجة مصفوفة لتعزيز الثدي تكون الأورام الخلايا الظهارية والغزو إلى 2،3 الأنسجة المحيطة بها.
مما يثير الاهتمام في هذا mechanosignنتائج النشاط aling في عملية تعرف باسم durotaxis، التي تهاجر الخلايا بشكل تفضيلي نحو الركيزة أكثر جمودا 4،5. الخلايا تستشعر باستمرار الخصائص الفيزيائية للبيئتهم خارج الخلية من خلال إنتغرين مستقبلات ملزمة لECM. وهذا، بدوره، ويشجع على تراكم العديد من البروتينات الهيكلية ويشير إلى المجالات الخاصة بهم حشوية لدفع تشكيل هياكل لاصقة المعروفة باسم التصاقات تنسيق أو اتصالات التنسيق 6،7. منذ integrins ليس لها النشاط الأنزيمي الأصيل، يتم ترحيل الإشارات من ECM من خلال هذه البروتينات التبعي لتنسيق استجابة الخلية لتغيير بيئتهم 8. وفقا لذلك، وتحديد وتوصيف البروتينات الرئيسية المشاركة في تنظيم mechanosignaling وdurotaxis هو مجال هام من مجالات التحقيق.
وقد تم تطوير نظم نموذج مختلف لدراسة durotaxis في المختبر، ولكن معظم لديهاتستخدم المغلفة الكولاجين ركائز بولي أكريلاميد 4. ومع ذلك، فإن إعداد ركائز بولي أكريلاميد يمكن أن يكون تحديا فنيا ويجب أن يكون الكولاجين المستخدمة في هذه المقايسات crosslinked كيميائيا لالركيزة 9. وقد ثبت Polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز لعرض خصائص ميكانيكية مشابهة لركائز بولي أكريلاميد 10. ومع ذلك، يتم ببساطة عن طريق خلط نسبة من القاعدة إلى crosslinker إعداد ركائز PDMS ويمكن أن تطلى هذه ركائز مع بروتينات ECM دون الحاجة إلى يشابك الكيميائي، مما يجعل PDMS أداة أسهل لدراسة آثار صلابة على سلوك الخلية. هنا، نحن تصف كيفية إعداد غرفة durotaxis بسيطة التي تم دمج PDMS الركيزة لينة مع ساترة الزجاج جامدة.
الفحص، على النحو المبين أدناه، يوفر طريقة سريعة وبسيطة لدراسة durotaxis. لهذه الدراسة استخدمنا خلايا عظمية U2OS الإنسان جنبا إلى جنب مع سيرنا بوساطةضربة قاضية من cdGAP لدراسة دور هذا البروتين التصاق التنسيق في durotaxis 11. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لتلبية الاحتياجات الفردية. قد تكون بديلا أنواع الخلايا الأخرى للخلايا U2OS ويمكن طرقت أي بروتين أسفل أو overexpressed لتحديد الآثار المترتبة على سلوك الخلية أثناء durotaxis. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لإدراج البروتينات الموسومة fluorescently لتحليل ديناميتها والسلوك باستخدام FRAP أو الحنق النهج.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis في الخلايا المهاجرة. A القوة الرئيسية من هذا الاختبار هو سهولة إعداد غرف durotaxis باستخدام PDMS. صلابة من ركائز يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير نسبة PDMS حل قاعدة لcrosslinker للسماح للدراسة الجمود المختلفة في الفحص. ومع ذلك، واحدة الحد المحت…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 GM47607، CA163296 وNSF 1334493 لCET. نشكر أعضاء المختبر تيرنر لقراءة نقدية للمخطوطة. استنسخت كل البيانات الواردة في هذا التقرير بإذن من رمر وآخرون. 2014 11.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
Riferimenti
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
