En forenklet system for evaluering Cell Mechanosensing og Durotaxis<em> In Vitro</em

Summary

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Abstract

For sammensetning og mekaniske egenskaper av den ekstracellulære matriks er svært variabel mellom vevstyper. Dette bindevev stroma mangfold sterkt påvirker celle atferd å regulere normale og patologiske prosesser, inkludert celledeling, differensiering, vedheft signalering og retnings migrasjon. I denne forbindelse, for å medfødt evnen av visse celletyper migrerer mot et stivere eller mindre kompatibel matrise substrat er referert til som durotaxis. Dette fenomenet spiller en viktig rolle under embryoutvikling, sårheling og kreftcelle invasjon. Her beskriver vi en enkel analyse for å studere durotaxis, in vitro, ved hjelp av polydimetyl-siloksan (PDMS) substrater. Fremstilling av den beskrevne durotaxis kamrene skaper en stivhet grensesnitt mellom det relativt myke PDMS gel og en stiv glass dekkglass. I eksempelet gitt, har vi brukt disse durotaxis kamre å demonstrere en rolle for cdc42 / Rac1 GTPase aktivere beskytti, cdGAP, i mechanosensing og durotaxis regulering i menneske U2OS osteosarkomceller celler. Denne analysen lett kan tilpasses til andre celletyper og / eller knockdown for andre proteiner av interesse å utforske sine respektive roller i mechanosignaling og durotaxis.

Introduction

Den ekstracellulære matriks (ECM) består av en kompleks rekke av strukturelle og kryssbindende proteiner inkludert kollagen, fibronektin og laminin. Selv om det er godt etablert at ECM gir viktig strukturell støtte for mobilnettet vev, er det økende bevis som tyder på at cellene aktivt svare på fysiske endringer i deres ECM miljø for å regulere ulike cellulære prosesser, inkludert celle overlevelse, differensiering og cellemigrasjon. For eksempel kan forskjeller i stivhet av ECM kjøre mesenchymale stamceller mot forskjellige linjene, med myke underlag (~ 1 kPa) fremme nevrogene linjer mens stive (~ 25 kPa) underlag fremme osteogent differensiering ^en. På samme måte har en økning av stromal matriks stivhet blitt vist å fremme mammary epitelcelle tumorigenesis og invasjon i det omkringliggende vev ^2,3.

Et spesielt interessant aspekt ved denne mechanosignaling aktivitet resulterer i en prosess som kalles durotaxis, der cellene migrerer fortrinnsvis mot et mer rigid substrat ^4,5. Celler kontinuerlig avføle de fysiske egenskapene til deres ekstracellulære miljø gjennom integrin-reseptor-binding til ECM. Dette i sin tur fremmer akkumulering av flere strukturelle og signaleringsproteiner til deres cytoplasmatiske domener til å drive dannelsen av klebende strukturer kjent som knutepunkter adhesjon eller fokale kontakter ^6,7. Siden inte har ingen iboende enzymatisk aktivitet, blir signalene videresendt fra ECM gjennom disse tilbehørs proteiner for å koordinere cellens respons på deres skiftende miljø ^8. Følgelig er identifiseringen og karakteriseringen av de sentrale proteiner involvert i regulering mechanosignaling og durotaxis et viktig område for undersøkelse.

Forskjellige modellsystemer har blitt utviklet for å studere durotaxis in vitro, men de fleste harbenyttes kollagen-belagt polyakrylamidprodukter substrater ^4. Imidlertid kan fremstillingen av polyakrylamid substratene være teknisk utfordrende og kollagen som brukes i disse assays, må være kjemisk tverrbundet til underlaget ^9. Polydimetylsiloksan (PDMS) substrater har vist seg å oppvise tilsvarende mekaniske egenskaper til de polyakrylamid-substrater ^10. Imidlertid er PDMS substrater fremstilles ved ganske enkelt å blande et forhold av base til tverrbindingsmidlet, og disse substrater kan belegges med ECM-proteiner uten behov for kjemisk tverrbinding, og dermed gjøre PDMS en enklere verktøy for å studere effektene av stivhet på celleadferd. Heri beskrives hvordan man skal fremstille en enkel durotaxis kammer hvor en myk PDMS substrat er integrert med en stiv dekkglass.

Analysen, som beskrevet nedenfor, gir en rask og enkel metode for å studere durotaxis. For denne studien brukte vi menneske U2OS osteosarkomceller celler kombinert med siRNA-mediertknockdown av cdGAP for å studere rollen til denne fokal adhesjon proteinet i durotaxis ^11. Viktigere, kan denne protokollen lett tilpasses individuelle krav. Andre celletyper kan erstatte U2OS cellene, og en hvilken som helst protein kan bli slått ned eller overuttrykt for å bestemme effektene på celle oppførsel under durotaxis. Videre kan denne protokollen tilpasses for å innlemme fluorescently tagget proteiner for å analysere sine dynamikk og atferd med FRAP eller FRET tilnærminger.

Protocol

1. Utarbeidelse av Durotaxis Chambers For å fremstille en 6-brønners vevkulturplate, kalibrer vekten med en 50 ml konisk rør. Veie ut ca. 10 g av PDMS basis løsningen i 50 ml rør (løsningen er ganske viskøs). For en 90: 1 substrat (Overholdelse av ~ 1 kPa), dele den målte vekt av PDMS baseoppløsning i røret ved 90 for å bestemme den riktige mengden av tverrbindingsmiddel-løsning er nødvendig. Legge til den beregnede mengde av tverrbindingsmiddel PDMS løsning på det samme rør. …

Representative Results

En skjematisk av durotaxis kammeret er vist i Figur 1A. Myk PDMS substrat (en 90: 1 blanding av PDMS basis til tverrbindingsmiddel-løsninger) er spredt i en 6 brønners skål og et glass dekkglass er plassert på toppen av PDMS, som deretter delvis dekker den øvre overflate av dekkglass, og dermed skape et grensesnitt mellom de to substrater av forskjellig samsvar. Stivheten til den myke PDMS substratet er ~ 1 kPa, noe som kan sammenlignes med den typiske overholdelse av hjernevev, me…

Discussion

Heri beskriver vi en enkel analyse for å studere durotaxis i migrere celler. En stor styrke av denne analysen er den enkle forberede durotaxis kamre ved hjelp PDMS. Stivheten av substratene kan lett manipuleres ved å endre forholdet av PDMS baseløsning til tverrbindingsmiddel for å tillate undersøkelse av forskjellige stivheter i analysen. Imidlertid er en potensiell begrensning av systemet som cellene blir kun utsatt for en enkelt endring i substratet stivhet i motsetning til opplever en stivhet gradient som er gi…

Materials

Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12mm	Fisher Scientific	12-545-82
6-well plate	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-Glutamine	Cellgro	25-005-CI
Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
Fibronectin	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
Falcon tubes	Celltreat	229456
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
U2OS cells	ATCC	HTB-96