Упрощенная система для оценки клеточной Mechanosensing и Durotaxis<em> In Vitro</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
Состав и механические свойства внеклеточной матрицы сильно различаются между типами тканей. Это соединительной ткани стромы разнообразие значительно влияет поведение клеток регулировать нормальные и патологические процессы, включая пролиферацию клеток, их дифференциации, адгезии сигнализации и направленной миграции. В связи с этим, врожденная способность некоторых типов клеток мигрировать в направлении жесткой, или менее совместимый подложке матрицы обозначается как durotaxis. Это явление играет важную роль во время эмбрионального развития, заживления ран и инвазии раковых клеток. Здесь мы опишем простой анализ для изучения durotaxis, в пробирке, используя полидиметилсилоксановые (PDMS) субстратов. Подготовка описанный durotaxis камер создает жесткость интерфейс между относительно мягкой PDMS гель и жесткой покровного стекла. В приведенном примере мы использовали эти durotaxis камеры, чтобы продемонстрировать роль для Cdc42 / Rac1 ГТФ активации PROTEв, cdGAP, в mechanosensing и durotaxis регулирования в человека U2OS клеток остеосаркомы. Этот анализ легко адаптируется к другим типам клеток и / или нокдаун других белков интересов, чтобы исследовать их соответствующие роли в mechanosignaling и durotaxis.
Introduction
Внеклеточный матрикс (ЕСМ) состоит из сложного набора структурных и сшивающих белков, включая коллаген, фибронектин и ламинин. Хотя это хорошо известно, что ЕСМ обеспечивает важную структурную поддержку для сотовых тканей, появляется все больше доказательств, чтобы указать, что клетки активно реагировать на изменения физических в их среде ECM регулировать различные клеточных процессов, включая выживаемости клеток, дифференциации и миграции клеток. Например, различия в жесткости ECM может управлять мезенхимальные стволовые клетки к различным линий, с мягкими подложками (~ 1 кПа), способствующих нейрогенные клоны, а жесткие (~ 25 кПа) субстраты способствовать остеогенной дифференцировки 1. Аналогичным образом, увеличение жесткости матрицы стромальных было показано способствовать молочной эпителиальных клеток и образование опухолей вторжение в окружающие ткани 2,3.
Особенно интересный аспект этого mechanosignРезультаты Алинг активности в процессе, известном как durotaxis, в которых клетки мигрируют преимущественно в сторону более жесткой подложке. 4,5 Клетки постоянно ощущать физические характеристики их внеклеточной среде через рецептора интегрина связываться с ЕСМ. Это, в свою очередь, способствует накоплению многочисленных структурных и сигнальных белков в их цитоплазматических доменах для управления формирование липких структур, известных как фокальные адгезии или фокальных контактов 6,7. Так интегрины нет присущей ферментативной активности, сигналы передаются от ECM с помощью этих вспомогательных белков координировать реакцию клетки на их изменяющейся среде 8. Соответственно, идентификация и характеристика основных белков, участвующих в регуляции mechanosignaling и durotaxis является важной областью исследования.
Различные системы модели были разработаны для изучения durotaxis в пробирке, но большинство из нихиспользуемые коллаген-покрытием полиакриламидные субстраты 4. Тем не менее, подготовка полиакриламидных подложек может быть технически сложной и коллаген используется в этих анализах должны быть химически сшитый с подложкой 9. Полидиметилсилоксан (PDMS) подложки, как было показано, чтобы показать сопоставимые механические свойства в полиакриламидных подложек 10. Тем не менее, PDMS подложки получают путем простого смешивания отношение основания к сшивающего агента и эти субстраты могут быть покрыты белков ЕСМ без необходимости химической сшивки, тем самым ПДМС легче инструмент для изучения влияния жесткости на поведение клеток. Здесь мы опишем, как подготовить простую durotaxis камеру, в которой мягкий PDMS субстрат интегрированной с жесткой покровного стекла.
Анализ, как описано ниже, обеспечивает быстрый и простой способ для изучения durotaxis. Для этого исследования мы использовали U2OS клеток остеосаркомы человека в сочетании с миРНК опосредованногонокдаун cdGAP изучить роль этого белка фокальной адгезии в durotaxis 11. Важно отметить, что этот протокол может быть легко адаптированы к индивидуальным требованиям. Другие типы клеток могут быть заменены U2OS клеток и любой белок может быть сбит или избыточно экспрессируется определить воздействие на поведение клеток при durotaxis. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для включения флуоресцентно меченных белков для анализа их динамики и поведения, используя FRAP или беспокоиться подходы.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом мы опишем простой анализ для изучения durotaxis в миграции клеток. Одним из основных преимуществ данного метода является простота подготовки durotaxis камеры, используя PDMS. Жесткость субстратов можно легко манипулировать, изменяя соотношение PDMS раствора основания, чтобы сшивающему что?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается NIH R01 GM47607, CA163296 и NSF 1334493 в CET. Мы благодарим членов лаборатории Тернера за критическое прочтение рукописи. Все данные, представленные в данном отчете были воспроизведены разрешения Вормер др. 2014 11.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
Riferimenti
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
