Un sistema simplificado para la evaluación de la célula Mechanosensing y Durotaxis<em> In Vitro</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
Las propiedades de la composición y mecánicas de la matriz extracelular son muy variables entre los tipos de tejidos. Esta diversidad estroma de tejido conectivo en gran medida el comportamiento celular impactos para regular los procesos normal y patológico incluyendo la proliferación celular, la diferenciación, la señalización de adhesión y migración direccional. En este sentido, la capacidad innata de ciertos tipos de células para migrar hacia un sustrato de matriz más rígida, o menos compatible que se conoce como durotaxis. Este fenómeno juega un papel importante durante el desarrollo embrionario, la reparación de heridas y la invasión de células de cáncer. A continuación, describimos un ensayo sencillo para estudiar durotaxis, in vitro, usando sustratos (PDMS) de polidimetilsiloxano. Preparación del descrito durotaxis cámaras crea una interfaz de rigidez entre el gel PDMS relativamente blando y un cubreobjetos de vidrio rígida. En el ejemplo, hemos utilizado estos durotaxis cámaras para demostrar un papel para el cdc42 / Rac1 GTPasa prote activaciónen, cdGAP, en mechanosensing y durotaxis regulación en células de osteosarcoma U2OS humanas. Este ensayo es fácilmente adaptable a otros tipos de células y / o desmontables de otras proteínas de interés, para explorar sus respectivas funciones en mechanosignaling y durotaxis.
Introduction
La matriz extracelular (ECM) se compone de una serie compleja de proteínas estructurales y de reticulación incluyendo el colágeno, fibronectina y laminina. Aunque está bien establecido que el ECM proporciona importante apoyo estructural a los tejidos celulares, cada vez hay más pruebas que indican que las células responden activamente a los cambios físicos en su entorno de ECM para regular diversos procesos celulares, incluyendo la supervivencia celular, la diferenciación y migración celular. Por ejemplo, las diferencias en la rigidez de la ECM pueden conducir las células madre mesenquimales hacia diferentes linajes, con sustratos blandos (~ 1 kPa) que promueven linajes neurogénicos mientras sustratos rígidos (~ 25 kPa) promueven la diferenciación osteogénica 1. Del mismo modo, un aumento en la rigidez de la matriz estromal ha sido demostrado para promover la tumorigénesis mamaria de las células epiteliales y la invasión en el tejido circundante 2,3.
Un aspecto particularmente interesante de este mechanosignresultados de la actividad aling en un proceso conocido como durotaxis, en el que las células migran preferentemente hacia un sustrato más rígido 4,5. Las células constantemente sentido, las características físicas de su entorno extracelular a través de receptor de integrina de unión a la ECM. Esto, a su vez, promueve la acumulación de numerosas proteínas estructurales y de señalización a sus dominios citoplásmicos para impulsar la formación de estructuras adhesivas conocidas como adhesiones focales o contactos focales 6,7. Desde integrinas no tienen actividad enzimática intrínseca, las señales se transmiten desde el ECM a través de estas proteínas accesorias para coordinar la respuesta de la célula a su entorno cambiante 8. En consecuencia, la identificación y caracterización de las proteínas clave que intervienen en la regulación de mechanosignaling y durotaxis es un área importante de investigación.
Varios sistemas de modelos se han desarrollado para estudiar durotaxis in vitro, pero la mayoría tienenutilizados sustratos revestidos con colágeno de poliacrilamida 4. Sin embargo, la preparación de los sustratos de poliacrilamida puede ser técnicamente difícil y el colágeno utilizado en estos ensayos debe ser reticulado químicamente al sustrato 9. Sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) se ha demostrado que exhiben propiedades mecánicas comparables a los sustratos de poliacrilamida al 10. Sin embargo, los sustratos de PDMS se preparan por simple mezcla de una proporción de la base a agente reticulante y estos sustratos pueden estar recubiertos con proteínas ECM sin la necesidad de reticulación química, haciendo así más fácil PDMS una herramienta para estudiar los efectos de rigidez en el comportamiento celular. En este documento, se describe cómo preparar una cámara durotaxis simple en el que un sustrato suave PDMS se integra con un cubreobjetos de vidrio rígido.
El ensayo, como se indica a continuación, ofrece un método rápido y sencillo para estudiar durotaxis. Para este estudio se utilizaron células de osteosarcoma U2OS humanas combinadas con mediada por siRNAdesmontables de cdGAP para estudiar el papel de esta proteína de adhesión focal en durotaxis 11. Es importante destacar que este protocolo se puede adaptar fácilmente a las necesidades individuales. Otros tipos de células pueden ser sustituidos por las células U2OS y cualquier proteína pueden ser derribados o sobreexpresa para determinar los efectos sobre el comportamiento celular durante durotaxis. Además, este protocolo puede ser adaptado para incorporar proteínas etiquetadas con fluorescencia para analizar su dinámica y el comportamiento utilizando FRAP o FRET enfoques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un ensayo simple para estudiar durotaxis en la migración de las células. Una de las principales de este ensayo es la facilidad de preparación de las cámaras durotaxis utilizando PDMS. La rigidez de los sustratos puede ser manipulado fácilmente cambiando la relación de la solución de base de PDMS a reticulante para permitir el estudio de diversas rigideces en el ensayo. Sin embargo, una limitación potencial del sistema es que las células sólo están expuestos a un solo cambio en la rigidez del…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el NIH R01 GM47607, CA163296 y NSF 1.334.493 de CET. Damos las gracias a los miembros del laboratorio Turner para la lectura crítica del manuscrito. Todos los datos que se muestran en este informe fueron reproducidas con permiso de Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
Riferimenti
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