Molte cellule di mammifero migrano preferenzialmente verso una matrice o substrato più rigido attraverso la durotassi. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un semplice sistema in vitro che possa essere utilizzato per studiare e manipolare i comportamenti della durotassi cellulare incorporando substrati di polidimetilsilossano (PDMS) di rigidità definita, interfacciati con vetrini.
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Articolo metodologico
Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proprietà meccaniche e composizione della matrice extracellulare sono molto variabili tra i tipi di tessuto. Questo connettivo diversità stroma del tessuto notevolmente comportamento impatti cella per regolare i processi normali e patologiche tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la segnalazione di adesione e la migrazione direzionale. A questo proposito, la capacità innata di certi tipi di cellule a migrare verso un substrato matrice rigida, o meno compatibile è indicato come durotaxis. Questo fenomeno ha un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale, la riparazione delle ferite e l'invasione delle cellule tumorali. Qui, descriviamo un test semplice per studiare durotaxis, in vitro, utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) substrati. Preparazione del descritto durotaxis camere crea un'interfaccia tra la rigidità relativamente morbido gel PDMS e un vetrino di vetro rigida. Nell'esempio fornito, abbiamo usato queste durotaxis alloggiamenti per dimostrare un ruolo per il Cdc42 / Rac1 GTPasi prote attivazionein, cdGAP, in mechanosensing e durotaxis regolazione nelle cellule umane U2OS osteosarcoma. Questo test è facilmente adattabile ad altri tipi e / o atterramento di altre proteine di interesse cellulari per esplorare i loro rispettivi ruoli nel mechanosignaling e durotaxis.
Introduzione
La matrice extracellulare (ECM) è costituito da una serie complessa di proteine strutturali e reticolazione compreso collagene, fibronectina e laminina. Anche se è noto che l'ECM fornisce un importante supporto strutturale per tessuti cellulari, ci sono sempre più prove per indicare che le cellule rispondono attivamente ai cambiamenti fisici nel loro ambiente ECM per regolare i processi cellulari diversi, tra cui la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e la migrazione delle cellule. Ad esempio, le differenze nella rigidità della ECM può guidare le cellule staminali mesenchimali verso differenti linee, con i substrati molli (~ 1 kPa) promuovono lignaggi ....
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Protocollo
1. Preparazione di Durotaxis Chambers
- Per preparare un 6-pozzetti di coltura tissutale, tarare la bilancia con un tubo da 50 ml. Pesare circa 10 g della soluzione di base PDMS nel tubo da 50 ml (la soluzione è abbastanza viscoso).
- Per 90: 1 substrato (Compliance di ~ 1 kPa), dividere il peso misurato della soluzione di base PDMS nel tubo 90 per determinare la corretta quantità di soluzione reticolante necessaria. Aggiungere la quantità calcolata di soluzione reticolante PDMS al tubo stesso.
Esempio: 10 g / 90 = 0,11 g. Aggiungere 0,11 g della soluzione reticolante PDMS alla soluzione di base PDMS.
NOTA: La base e reticolante soluzio....
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Risultati
Uno schema della camera durotaxis è mostrato nella Figura 1A. Substrato PDMS molle (90: 1 miscela di base di PDMS a reticolante soluzioni) si sviluppa in un piatto 6 pozzo e un vetrino di vetro è posto sulla parte superiore delle PDMS, che poi ricopre parzialmente la superficie superiore del vetrino, creando un'interfaccia tra i due substrati di conformità diverso. La rigidità del substrato PDMS morbido è ~ 1 kPa, che è paragonabile alla conformità tipica del tessuto cerebrale, ment.......
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Discussione
Qui descriviamo un semplice test per studiare durotaxis in migrazione delle cellule. Un punto di forza di questo saggio è la facilità di preparazione delle camere durotaxis con PDMS. La rigidità dei substrati può essere facilmente manipolata modificando il rapporto di soluzione di base PDMS a reticolante per consentire lo studio di varie rigidità nel test. Tuttavia, una potenziale limitazione del sistema è che le cellule sono esposte a un solo cambiamento di rigidità del substrato rispetto a sperimentare un gradiente ri.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da NIH R01 GM47607, CA163296 e NSF 1.334.493 di CET. Ringraziamo i membri del laboratorio Turner per la lettura critica del manoscritto. Tutti i dati riportati nella presente relazione sono stati riprodotti da permesso da Wormer et al. 2014 11.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Polidimetilsilossano (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Kit di elastomeri siliconici |
| #1 Vetro di copertura 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Piastra a 6 pozzetti | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutammina | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodio Piruvato | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillina/Streptomicina | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectina | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Tubi di falco | Celltreat | 229456 | |
| Siero fetale bovino | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma | A7906 | |
| U2OS cellule | ATCC | HTB-96 |
Riferimenti
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., <....
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Ristampe e permessi
