Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung
Summary
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Abstract
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Introduction
Proteom-Experimente, die Massenspektrometrie (MS) können so gestaltet werden, entweder nicht-zielgerichtete (Schrotflinte) oder gezielte Methoden verwenden. Entdeckung Proteomik beruht in der Regel auf Bottom-up-Schrotflinte MS, entweder durch die Verwendung eines herkömmlichen datenabhängigen Erfassungsmodus oder mit Hilfe eines der neu entwickelten Datenunabhängige Techniken (zB MS E, SWATH) 1,2. Shotgun Proteomics ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Hochdurchsatz-Peptid-Identifikation und relative Quantifizierung, aber es in der Regel für die absolute Quantifizierung oder auf kleine, definierte Sets (~ zig) von Proteinen ungeeignet ist. Die MS-Methode die am häufigsten für gezielte Proteomics ist wegen seiner hohen Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Dynamik 3-5 gewählten Reaktionsüberwachung (SRM). Alternativen zu SRM sind parallel Reaktionsüberwachung, die Vorteile der hochauflösenden Voll MS Scan-6 nimmt.
SRM ist in der Regel unter Verwendung einer Nanofluss reverSED Phasen-Hochleistungschromatographie (Nano RP-LC) Gerät in einen Nanoelektrospray-Ionisations (nano-ESI) Ionenquelle zu einer Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (QqQ-MS) angebracht ist. In einem typischen Experiment werden Probenproteinen proteolytisch verdaut und die resultierenden Peptide werden chromatographisch getrennt, desorbiert und ionisiert. Die erhaltenen Vorläuferionen m / z durch den ersten Quadrupol (Q1) gefiltert und fragmentiert in der zweiten Quadrupol (Q2) durch Kollision sie mit einem Stoßgas. Die resultierenden Fragmentionen m / z-gefiltert in dem dritten Quadrupol (Q3) und durch eine Dynode quantifiziert. Jedes Vorläufer- und Fragmentionenpaar wird als Übergang bezeichnet, und jeder Übergang wird für eine bestimmte Zeitdauer (die Verweilzeit, typischerweise 2-50 ms) überwacht. Während LC-SRM, die QqQ-MS durchläuft einer vordefinierten Liste von Übergängen (das Tastverhältnis ist typischerweise ≤3 s) und ein Chromatogramm jedem Übergang entsteht.
Alternative strategies zur Proteinquantifizierung verwenden in der Regel Immunoassays wie Dot-Blots, Western Blots, ELISAs, Antikörper-Mikroarrays, Reverse-Phase-Protein-Microarrays, Mikrofluid-Immunoassays, digital ELISAs, und Mikrokügelchen basierende Immunoassays 7. Die besten Immunoassays deutlich empfindlicher als LC-SRM ist, und der Probendurchsatz von Immunoassays deutlich höher als die der LC-SRM 5 sein. Jedoch kann die Entwicklung Immunoassays teuer und / oder zeitaufwendig, und die resultierenden Assays können anfällig für Cross-Reaktivität und / oder Störungen, inkompatibel mit Zell- / Gewebe Lyse / Homogenisierungsverfahren werden und / oder nicht zugänglich Multiplexen 5,8. Einige dieser Probleme können durch Kopplung Antikörper- und MS-basierte Techniken behandelt werden. Zum Beispiel können Zielproteine mittels Immunpräzipitation vor Proteolyse und LC-SRM 9-12 angereichert werden. Alternativ verwendet der SISCAPA Technik Immunpräzipitation im Anschluss an die Proteolyse im Peptid level 13,14. Neben Strategien immunoenrichment kann Immunodepletion hoher Fülle Proteine eingesetzt werden, um LC-SRM Empfindlichkeit durch Reduzieren von Interferenz erhöhen koeluierender Analyten 15,16.
MS-basierte Proteinquantifizierung kann in relative und absolute Quantifizierung in markierungsfreien und stabilen Isotopenmarkierung (zB metabolische Markierung, chemische Markierung, und Heavy-markiertem Protein und Peptid-interne Standards) unterteilt werden, und auch. Markierungsfreie Techniken können nützlich für die relative Proteinquantifizierung, sind aber für eine genaue absolute Quantifizierung ungeeignet. Im Vergleich dazu haben Markierungstechniken Fehler mit Probenvorbereitung und MS assoziierten Varianz reduziert und werden häufig für die relative Proteinquantifizierung 17 eingesetzt. Zum Beispiel unter Verwendung einer kultivierten humanen Zelllinie aktiviert relative Quantifizierung Biomarkern über LC-SRM von menschlichem Serum 18 hergestellten stabilen Isotop markiert Proteoms (SILAP) -Standards. Genaue absolute Proteinquantifizierung von MS verlangt, dass gereinigte, quantifiziert, isotopenmarkierte Protein oder Peptid internen Standards versetzt, in biologischen Proben vor der MS werden. Der Einbau von schweren Isotopen-markierten internen Standards in ein LC-SRM-Workflow ermöglicht absolute Quantifizierung, die nachweislich hoch reproduzierbar und übertragbar zwischen Laboratorien 16,19 sein.
Stabiles Isotop markierten internen Standards für die absolute Proteinquantifizierung von MS gehören Peptid-Standards unter Verwendung von Festphasensynthese 20, Proteine von verketteten Protease-spaltbare Peptidstandards 21, und in voller Länge Proteinstandards 22 vorbereitet. Zielprotein kovalente Modifikation und unvollständig Probenvorbereitung (dh unvollständige Lyse der Probe und Homogenisierung und unvollständiges Protein-Solubilisierung Denaturierung, Alkylierung und Proteolyse) kann eine genaue Quantifizierung zu untergraben. Interne protein Normen sind die am wenigsten von den meisten dieser potentiellen Probleme betroffen sein, aber sie sind in der Regel die schwierig herzustellen. Eine Alternative ist es, jede Zielprotein Verwendung mehrerer interner Peptidstandards, die dazu bestimmt sind, Amino- und Carboxy-terminalen nativen flankierenden Reste umfassen analysieren. Unabhängig davon, welche Art von interner Standard verwendet wird, sollte es während der Probenvorbereitung wie möglich Spike-in werden die biologischen Proben in einem möglichst frühen Zeitpunkt. Außerdem sollten mehrere Probenpräparationstechniken (zB unterschiedliche Denaturierungsbedingungen) getestet werden. Die Verwendung von mehreren orthogonalen experimentellen Techniken (experimentell Kreuzvalidierung) ist eine praktikable Strategie zur Überwindung meisten Quantifizierung mögliche Herausforderungen 23-25.
LC-SRM Quantifizierung von Proteinen ist ein sehr flexibles Verfahren, das in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet worden ist. Bemerkenswerterweise wurde verwendet, um Peptid- und Protein-Biomarkern in studierenklinischen Proben, wie Serum, Stanzbiopsien und Feinnadelabsaugungen 5. LC-SRM ist auch verwendet worden, um die Stöchiometrie von Proteinkomplexen 5,26 messen, Botulinumneurotoxine 27 zu erfassen, um die Proteinphosphorylierung Dynamik innerhalb Signalwege 5 quantifizieren und um Änderungen in der Proteinkonformation 28 zu quantifizieren.
Unser Labor ist mit LC-SRM, die Signalproteine, die Makrophagen-Chemotaxis vermitteln, um die Entwicklung von Chemotaxis Signalweg Simulationen unterstützt quantifizieren. Das Gesamtkonzept des Protokolls (Abbildung 1) beginnt mit Ranking der vorläufige Soll Peptide. Anschließend werden rohe externen Peptidstandards synthetisiert und verwendet werden, um LC-SRM-Assays für die qualitative Analyse von biologischen Proben zu entwickeln. Wenn der biologischen Probe stammenden Zielpeptid erfaßt wird, werden gereinigte Schwer markierten internen Peptid-Standards für die quantitative LC-SRM hergestellt. Dieses Protokoll kann zu ac verwendet werdennau Quantifizierung von Proteinen aus einer Vielzahl von biologischen Proben und zur Untersuchung einer Vielzahl von Proteinziele zu unterstützen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Absolute Proteinquantifizierung ist für ein sehr breites Spektrum von biomedizinischen Anwendungen, wie Biomarker-Validierung und Signaltransduktionsweg Modellierung. Vor kurzem hat gezielte Proteomik mit LC-SRM von Verbesserungen an zahlreichen Technologien, einschließlich Peptidstandardpräparat, HPLC, QqQ-MS und LC-SRM Datenanalyse profitiert. Folglich ist es eine leistungsfähige Alternative zu Immunoassays. Immunoassays können extrem empfindlich und Hochdurchsatz, aber die Entwicklung einer robusten Immuntest ka…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
| LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
| LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
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