Kvantifiering av cytosoliska vs. vakuolär<em> Salmonella</em> I primära makrofager genom Differential Permeabilization

Summary

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Abstract

Intracellulära bakteriepatogener kan replikera i cytosolen eller i specialiserade patogen innehåller vakuoler (PCVs). För att nå cytosolen, bakterier som Shigella flexneri och Francis novicida måste inducera brott på phagosome. Däremot replikerar Salmonella typhimurium i en vakuolär utrymme, kallad Salmonella innehållande vacuole (SCV). Men vissa mutanter av Salmonella inte upprätthålla SCV integritet och därmed frigörs i cytosolen. Andelen cytosoliskt vs. vakuolära bakterier på nivån av enstaka bakterier kan mätas genom differentiell permeabilization, även känd som phagosome-skyddsanalys. Tillvägagångssättet gör användningen av fastigheten av tvättmedel digitonin att selektivt binda kolesterol. Eftersom plasmamembranet innehåller mer kolesterol än andra cellulära membran, kan digitonin användas för att selektivt permeabilisera plasmamembranet medan intracellulära membranintakt. I korthet, efter infektion med patogenen som uttrycker ett fluorescerande markörprotein (t ex mCherry bland andra), är plasmamembranet hos värdceller permeabiliserades med en kort inkubering i digitonin innehållande buffert. Celler tvättas sedan och inkuberas med en primär antikropp (kopplad till en fluorofor val) riktad mot bakterien av val (t.ex. mot Salmonella -FITC) och tvättades igen. Om omärkta bakterier används, kan ett ytterligare steg utföras, där alla membran permeabiliseras och alla bakterier färgas med en motsvarande antikropp. Efter färgning, kan den procentuella andelen av vakuolära och cytosola bakterier kvantifieras genom FACS eller mikroskopi genom att räkna enkel- eller dubbel positiva händelser. Här ger vi experimentella detaljer för användning av denna teknik med bakterien Salmonella typhimurium. Fördelen med denna analys är att, i motsats till annan analys, ger det en kvantifiering på nivån av enda bacteria, och om analyserades genom mikroskopi ger det exakta antalet cytosoliskt och vakuolära bakterier i en given cell.

Introduction

Intracellulära bakteriepatogener replikera antingen direkt i värdcellen cytosolen eller i specialiserade vakuolära fack ^1. Under det inledande skedet av infektionen flesta patogener får internaliseras antingen genom fagocytos av specialiserade celler (såsom makrofager) eller genom att aktivt främja sin egen upptag i icke-fagocytiska celler. I fagocytceller, den phagosome säkringar normalt med lysosomer för att bilda en nedbrytande fack, där fagocyterade partiklarna smälts. Specialized cytosoliska bakterier, såsom Francis novicida eller Shigella flexneri, fly phagosomal nedbrytning genom att inducera bristning av phagosome och därefter undkomma in i cytosolen ^2,3. Detta kräver virulens-associerad mekanism såsom Francis patogenitetsindex Island (FPI) eller Shigella flexneri T3SS, som injicerar effektorproteiner som främjar vakuolär bristning ^2-4. De värdcell cytosol funktionerett antal bevarade mönsterigenkänningsreceptorer som normalt känner igen närvaron av patogener och inducerar medfödda immun signalering ^5. Dessutom xenophagy, kan ett antimikrobiellt form av autophagy nedbryta bakterier som kommer in i cytosolen. Cytosoliska bakterier normalt väl anpassade till trubbiga eller kringgå dessa svar med hjälp av olika strategier. Till exempel, Francis modifierar sina LPS för att undvika värd erkännande och Shigella förhindrar autophagy rekrytering med hjälp av utsöndrade effektorproteiner ^6,7.

En annan strategi för att undkomma lysosomal nedbrytning är anställd av modellen vakuolär patogenen Salmonella enterica serovar Typhimurium, därefter kallas Salmonella typhimurium. Salmonella använder en T3SS att injicera effektenheter som renovera den ursprungliga phagosome i sin intracellulära nisch, Salmonella innehållande vacuole (SCV) ^8,9. Kontinuerlig manipulation av värdvägar ärnödvändigt att behålla denna vakuolen genom att rekrytera lipider och andra näringsämnen till vakuolen. Faktiskt en sifa mutant av Salmonella inte upprätthåller vakuolär stabilitet, och kommer in i cytosolen hos värdceller inom timmar efter infektion, vilket resulterar i aktivering av medfödda immunvägar och autophagy rekrytering ^8. Vakuolär utsläpp av Salmonella varierar beroende på den celltyp som är studier, och flera rapporter har visat att även WT Salmonella i epitelceller kan fly SCV och hyperreplicate i cytosolen ^10. Färska rapporter visar att medfödda immun detektion av vakuolära patogener beror också på förmågan hos värd att erkänna och destabilisera patogen innehåller vakuoler (PCVs) ^11-14.

Med tanke på att både värd eller bakterier genotyp kan påverka fördelningen av intracellulära bakterier mellan vakuolära och cytosoliska utrymmet, är det nödvändigt att kvantifiera antalet vakuolär vs.cytosoliska bakterier. Eftersom det i de flesta experimentella uppställningar värdceller infekteras med mer än en bakterie, och därefter kan hysa flera bakterier i olika subcellulära avdelningar, krävs en teknik som tillåter kvantifiering av nivån av enskilda bakterier. Differential permeabilisering (även känd som phagosomal skyddsanalys) ger denna resolution ^2,4,10,12. Analysen är baserad på selektiv permeabilisering av värdcellens plasmamembran med detergenten digitonin, vilket lämnar vakuolära membran intakt och medger sålunda selektiv färgning av cytosoliska bakterier med antikroppar. Här ger vi två protokoll för kvantifiering av cytosoliska och vakuolär Salmonella typhimurium med hjälp av differential permeabilization. Principen för denna metod beskrivs i figur 1: Bone-märg härledda makrofager (BMDMs) infekteras med stationär fas mCherry uttryck Salmonella. Stationär fas Salmonella behöver to användas eftersom de nedreglera uttryck av SPI-1 T3SS, vars verksamhet annars skulle erkännas av NLRC4 inflammasome och inducerar snabb celldöd (pyroptosis) i BMDMs ^15. Efter infektion tvättas cellerna och behandlades med 50 ^ g / ml av digitonin för en minut. Celler tvättas omedelbart igen och inkuberades med anti-Salmonella-antikroppar kopplade till FITC att markera bakterier med tillgång till cytosolen. Efter ytterligare tvättsteg cellerna lyseras och den procentuella andelen av mCherry + (vakuolär) och FITC + / mCherry + (cytosolisk) bakterier bestäms genom FACS. Vi rapporterar också en anpassning av denna metod som kan användas om inga fluorescerande proteinuttryckande stammar är tillgängliga (Figur 2). Ytterligare steg införs efter FITC märkning där cellerna är fasta och helt permeabilized. Därefter alla bakterier färgas med anti-Salmonella antikroppar och motsvarande sekundära antikroppar. Detektion görs sedan genom mikroskopi i stället för FACS-analys.

Protocol

1. Digitonin Analys med mCherry-uttryckande Salmonella (FACS-baserad analys) Förberedelse bakterier Obs: Salmonella av vildtyp SL1344 (streptomycin resistent) som uttrycker mCherry från en plasmid (pFPV kodande mCherry under rpsM promotor) användes vid denna analys. Bakteriell fagocytos och spridning där inte ändrats genom konstitutivt uttryck av mCherry (data ej visade) 16. Inokulera stammen ett dygn före infektionen i 3 ml LB-medium kompletterat med strepto…

Representative Results

Figur 1 och Figur 2 visar schemat av digitonin analysen som beskrivs i protokoll 1 och protokoll 2 visar de kritiska stegen i protokollet och de resultat som uppnåtts. Figur 3 visar typiska FACS resultat. Positiva och negativa kontroller används för att ställa portarna för mCherry + / FITC- bakterier (vakuolär Salmonella) och mCherry + / FITC + bakterier (cytosolisk Salmonella). Baserat på dessa portar andelen cytosoliska och vakuolära bakterier kan bestämmas i de…

Discussion

Differential permeabilization är en enkel och robust metod för att analysera och kvantifiera subcellulära fördelningen av bakteriella patogener mellan vakuolära fack och cytosolen. Samma analys har använts med framgång med bakterier såsom Francis novicida ^2,4 och Shigella flexneri ^12. Men eftersom många intracellulär patogen ändra eller modifiera värd endomembrane strukturer kommer robustheten i digitonin permeabilization måste fastställas på individuell basis. Fini…

Materials

Digitonin	Sigma	D5628	50ug/mL
PFA	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
Potassium Acetate	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
BSA	Sigma	A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-MG	1/500
anti-Salmonella CSA-1	KPL	02-91-99-MG	1/500
anti-Calnexin	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
anti-PDI	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
Saponin	Sigma	47036
Vectashield mounting medium	Vectorlabs	H-1200
Anti Rabbit antibody-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
Glycine	Sigma	G8898
Gentamicin	Life Technologies	15710-49	100ug/mL and 10ug/mL
Triton X-100	Promega	H5141
PBS	Gibco	20012-019
DMEM	Sigma	D6429
NEAA	Amimed	5-13K00-H
LSM700 Confocal microscope	Zeiss		imaging done at 63x
FACS Fortessa	BD technologies		detection mCherry 610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		detection FITC 530 nm