अलगाव और माउस महाधमनी endothelial कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृति
Summary
The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.
Abstract
The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.
Introduction
संवहनी endothelium न केवल एक बाधा परत है कि रक्त और ऊतकों को अलग करती है, यह एक विशाल अंत: स्रावी ग्रंथि है कि 400 वर्ग मीटर 1 के एक सतह क्षेत्र के साथ पूरे संवहनी पेड़ पर फैला माना जाता है। endothelium की भलाई संवहनी homeostasis के लिए आवश्यक है। बेकार endothelium atherosclerosis, वेसकुलिटिस और ischemia / reperfusion चोट, आदि सहित विभिन्न 2-4 हृदय संबंधी विकार, में भाग लेता है। आज की तारीख तक इन रोग सेटिंग्स में शामिल विशिष्ट सेलुलर और आणविक तंत्र में अच्छी तरह से endothelium के विसरित शारीरिक प्रकृति के कारण समझ नहीं रहे हैं।
माउस अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल क्योंकि आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों और अधिक किसी भी अन्य स्तनधारी प्रजातियों में से चूहों में विकसित कर रहे है। हालांकि, प्राथमिक murine महाधमनी endothelial कोशिकाओं के अलगाव विशेष रूप से कठिन माना जाता है क्योंकि महाधमनी के छोटे आकार enzymat बनाता हैendothelium अव्यावहारिक के आईसी पाचन। कुछ प्रक्रियाओं को अलग-थलग करने और शुद्ध ईसीएस की आवश्यकता होती है 5-7 को सूचना दी।
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के किसी विशेष उपकरण का उपयोग किए बिना माउस महाधमनी से अलग और endothelial कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक सरल विधि का उपयोग करने के लिए है। इस प्रोटोकॉल में, हौसले से पृथक महाधमनी छोटे खंडों में कटौती और endothelium नीचे का सामना करना पड़ endothelial अंकुरण के लिए अनुमति देने के लिए के साथ एक मैट्रिक्स पर वरीयता दी गई है। बाद खंडों को हटा रहे हैं, endothelial कोशिकाओं endothelium इष्ट माध्यम में विस्तार किया है और दो या तीन मार्ग के बाद प्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं। वर्णित विधि के लाभ कर रहे हैं कि: 1) endothelial कोशिकाओं एक भी महाधमनी से काटा जाता है की काफी अधिक संख्या; 2) सेल व्यवहार्यता अच्छी तरह से संरक्षित है; और 3) कोई विशेष उपकरण या तकनीक की जरूरत है। यह endothelial सेल pathophysiology में विशिष्ट सेलुलर और आणविक तंत्र की पहचान करने का एक प्रभावी साधन प्रदान करता है। जो उन लोगों के जनसंपर्क का अध्ययन करने में रुचि रखते हैंया तो जीन नाक आउट चूहों से imary सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं, जीन दस्तक में चूहों, या एक murine मॉडल रोग, इस प्रोटोकॉल बहुत ही उपयोगी और अभ्यास करने के लिए आसान है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन से किसी भी विशेष उपकरण के बिना एक माउस महाधमनी से कोशिकाओं को अलग और संस्कृति endothelial के लिए एक सरल विधि को दर्शाता है। immunofluorescence धुंधला संकेत दिया है कि कोशिकाओं के बहुमत दूसरे पारित होने के बाद endothel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 and the National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). We thank Roberto Mendez from Wayne State University for assisting in the preparation of the manuscript.
Materials
| 4- or 6-week-old mice (Jackson Laboratory, #000664). |
| Sterile 1X phosphate-buffered saline (PBS, Gibco, #10010-023). |
| Sterile 1X PBS containing 1,000 U/ml of heparin (Sigma Aldrich, H3149). |
| Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium[DMEM] with 25mM HEPES[Gibco, #12320-032 ], supplemented with 100μg/ml endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma,#2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/ml heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000U/ml penicillin and 10mg/ml streptomycin [Gibco, #15140-122]). |
| Growth factor reduced matrix (BD Biosciences, #356231). |
| Neutral proteinase (Dispase, 1U/ml, Fisher Scientific #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034g/L[Sigma, #1255], in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose[Gibco, #12320-032 ]). |
| Gelatin (100‑200 μg/cm2, Sigma, #G1393). |
| 1,1`-dioctadecyl-3,3,3`,3`- tetramethylindo- carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL, Life Technologies, #L3484), FITC-labeled Ulex europeus agglutinin (Ulex-Lectin, Sigma, #L9006), Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody (BD Biosciences, # 553372). |
| Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody (Cell signaling, #9698), anti-mouse endothelial nitric oxide synthase (Abcam, #ab5589), anti-mouse vascular endothelium-cadherin (Abcam, #33168), anti-mouse calponin (Abcam, #700), FITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma, #F6005) |
| One ml syringe fitted with 25-G needle (Fisher Scientific, #50-900-04222). |
| 100mm Peri dishes (Fisher Scientific, #07-202-516). |
| Six-well cell culture plates (Fisher Scientific, #08-772-1B). |
| T12.5 cultuer flask (Fisher Scientific, #50-202-076) |
| Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade (Fine Science Tools, Inc) |
| Anesthesia machine with isoflurane (Webster Veterianary Supply, #07-806-3204), heating lamp |
| Centrifuge machine. |
| Inverted phase-contrast microscope. |
| inverted fluorescence microscope. |
Riferimenti
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis. Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).
- Wang, J. M., et al. C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation. Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).
- Wang, J. M., et al. Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects. American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory research. 14, 23 (2013).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).
- Bowden, R. A., et al. Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium. Circulation research. 90, 562-569 (2002).
- Lu, Y., et al. Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets. Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).
- Atkins, G. B., Jain, M. K. Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation research. 108, 929-939 (2008).
- Shimamoto, T. Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors). Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).
- Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).
- Rostgaard, J., Qvortrup, K. Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae. Microvascular research. 53, 1-13 (1997).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).
