マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

Summary

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Abstract

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Introduction

血管内皮細胞だけでなく、血液と組織を分離するバリア層であり、それを400正方形のメートル¹の表面積全体血管樹上に伸びる広大な内分泌腺と考えられています。内皮の幸福は、血管の恒常性に不可欠です。機能不全の内皮は、アテローム性動脈硬化症、血管炎および虚血/再灌流傷害など ^2-4を含む様々な心血管障害、に参加しています。現在までに、これらの疾患の設定に関与する特定の細胞および分子メカニズムはよく起因する内皮の拡散解剖学的性質のために理解されていません。

遺伝子操作技術は、より多くの任意の他の哺乳動物種に比べてマウスで開発されているので、マウスは、研究のための重要なモデルです。大動脈の小さなサイズがenzymatを作るためしかし、初代マウス大動脈内皮細胞の単離は、特に困難であると考えられています非現実的内皮のIC消化。いくつかは、電気部品を分離し、精製するための手順は^5-7を必要^と報告しました。

このプロトコルの目的は、特別な装置を使用せずに、マウスの大動脈から内皮細胞を分離し、展開する簡単な方法を使用することです。このプロトコルでは、新たに単離された大動脈は、小さなセグメントに切断され、内皮発芽を可能にするために下向きに内皮とマトリックス上に播種しました。セグメントが除去された後、内皮細胞は内皮好ま培地中で増殖し、二、三継代後の実験のために準備されています。記載された方法の利点は、その：1）単一の大動脈から収穫された内皮細胞のかなり高い数字。 2）細胞生存率がよく保存されています。 3）特別な装置や技術が必要とされません。これは、内皮細胞の病態生理学における特定の細胞および分子機構を同定する効果的な手段を提供します。広報の研究に興味がある人のためにimaryいずれかの遺伝子ノックアウトマウスから培養された内皮細胞は、遺伝子ノックインマウス、またはマウス疾患モデル、このプロトコルは、非常に有用と練習するのは簡単です。

Protocol

マウスからの大動脈の1の単離ここで説明するすべての手順は、ウェイン州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 麻酔器の誘導チャンバ内にマウスを置きます。 25％新鮮な空気と75％のO 2と併せて4％イソフルランの流れを設定します。イソフルランの吸入によりマウスを麻酔専用のノーズコーンに続く誘導室を経由して 25％?…

Representative Results

内皮細胞の萌芽 発芽自発的内皮細胞は、マウスの大動脈セグメントから開始しました。マウスの大動脈セグメントは4日間、内皮細胞増殖培地中で成長因子減少マトリックス上で増殖させました。 4日間 – 内皮細胞の発芽は通常2に表示されます。顕微鏡写真は、4日目（ 図1）に採取しました。写真に示すように、多数の内皮細胞は、セグメント?…

Discussion

この研究は、特別な装置なしで、マウスの大動脈から内皮細胞を分離し、培養するための簡単な方法を示しています。免疫蛍光染色は、細胞の大部分が第2の通路後の内皮細胞であったことを示しました。第3通路への第2の細胞は、in vitroのに適しており、in vivo実験における内皮生物学を研究することが示唆されています。

この議定書からのキ?…

Materials

4- or 6-week-old mice (Jackson Laboratory, #000664).

Sterile 1X phosphate-buffered saline (PBS, Gibco, #10010-023).

Sterile 1X PBS containing 1,000 U/ml of heparin (Sigma Aldrich, H3149).

Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium[DMEM] with 25mM HEPES[Gibco, #12320-032 ], supplemented with 100μg/ml endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma,#2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/ml heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000U/ml penicillin and 10mg/ml streptomycin [Gibco, #15140-122]).

Growth factor reduced matrix (BD Biosciences, #356231).

Neutral proteinase (Dispase, 1U/ml, Fisher Scientific #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034g/L[Sigma, #1255], in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose[Gibco, #12320-032 ]).

Gelatin (100‑200 μg/cm2, Sigma, #G1393).

1,1`-dioctadecyl-3,3,3`,3`- tetramethylindo- carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL, Life Technologies, #L3484),  FITC-labeled Ulex europeus agglutinin (Ulex-Lectin, Sigma, #L9006),  Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody (BD Biosciences, # 553372).

Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody (Cell signaling, #9698), anti-mouse endothelial nitric oxide synthase (Abcam, #ab5589), anti-mouse vascular endothelium-cadherin (Abcam, #33168), anti-mouse calponin (Abcam, #700), FITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma, #F6005)

One ml syringe fitted with 25-G needle (Fisher Scientific, #50-900-04222).

100mm Peri dishes (Fisher Scientific,  #07-202-516).

Six-well cell culture plates (Fisher Scientific, #08-772-1B).

T12.5 cultuer flask (Fisher Scientific, #50-202-076)

Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade (Fine Science Tools, Inc)

Anesthesia machine with isoflurane (Webster Veterianary Supply, #07-806-3204), heating lamp

Centrifuge machine.

Inverted phase-contrast microscope.

inverted fluorescence microscope.