T-cellen Capture Bacteriën door Transinfection van dendritische cellen
Summary
Hier een protocol wordt bacteriële capture meten door CD4 + T-cellen die tijdens antigeenpresentatie via transinfection van pre-geïnfecteerde dendritische cellen (DC). We zien hoe de noodzakelijke stappen uit te voeren: het isoleren van primaire cellen, infectie van DC, DC / T-cel conjugaat vorming, en meting van bacteriële T celtransfectie.
Abstract
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Introduction
Wanneer een ziekteverwekker infecteert de gastheer, is er meestal een activering van het aangeboren en adaptieve immuunreacties, noodzakelijk voor bacteriële verwijdering. Aangeboren immuniteit is de eerste verdedigingslinie die de meeste infecties voorkomt. Aangeboren immuniteit te onderscheiden op een nauwkeurige manier elementen die zijn geconserveerd onder brede groepen van micro-organismen (pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, PAMPs) 1. De mechanismen van aangeboren immuniteit omvatten fysische barrières zoals huid, chemische barrières (antimicrobiële peptiden, lysozyme) en de aangeboren leukocyten, waarbij de fagocyten (macrofagen, neutrofielen en dendritische cellen), mestcellen, eosinofielen, basofielen en natuurlijke killer cellen omvatten 2. Deze cellen herkennen en pathogenen te elimineren, hetzij door een aanval op hen door contact of via fagocytose, die pathogeen engulfing en doden omvat. Dit systeem staat niet toe levenslange verdediging, in tegenstelling tot adaptieve immuniteit, die immunologisch geheugen tegen p verlenenathogens. Het adaptieve immuunsysteem is de tweede verdedigingslinie en is in staat te herkennen en te reageren op specifieke antigenen van verschillende microbiële en niet-microbiële stoffen 3. De hoofdcomponenten van het adaptieve immuunsysteem zijn lymfocyten, die B- en T-cellen omvatten. B-cellen zijn betrokken bij de humorale respons, antilichamen uitscheiden tegen pathogenen of exogene eiwitten. Echter, T cellen zijn de celgemedieerde immuniteit, het moduleren van de immuunrespons met cytokinen afscheiding of doden pathogeen geïnfecteerde cellen 4.
Antigeen presenterende cellen (APC's) zoals dendritische cellen of macrofagen, bestanddelen van het aangeboren immuunsysteem, kan fagocytose pathogenen en verwerken bacteriële componenten in antigenen, die op het celoppervlak worden door de Major Histocompatibility Complex (MHC) 5-7 herkennen. Nadat APC ziekteverwekkers hebben phagocytized, zijn ze meestal migreren naar de drainerende lymfeklieren, waar ze interageren met Tcellen. T-lymfocyten kunnen specifieke peptide-MHC-complexen herkennen aan hun T-cel receptoren. De immune synaps (IS) optreedt in het grensvlak tussen een antigeen beladen APC en een lymfocyt tijdens antigeenpresentatie 8,9. Sommige bacteriën kunnen fagocytose overleven en systematisch te verspreiden binnen de APC's. In deze visie, geïnfecteerde APC's dienen als bacteriële reservoirs of "Trojaanse paarden", dat bacteriële spread 10 vergemakkelijken. Het intieme contact tussen APC's en de lymfocyten die plaatsvinden tijdens IS vorming ook functioneren als een platform voor de uitwisseling van een deel van membranen, genetisch materiaal en exosomes en kunnen gekaapt bepaalde virussen om T-cellen te infecteren; Dit proces heet transinfection 11-13.
Sommige pathogene bacteriën (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica en Shigella flexneri) kunnen T-lymfocyten dringen in vivo en hun gedrag 14-16 passen. We hebbenrecent beschreven dat T-lymfocyten kunnen ook bacteriën door transinfection van eerder geïnfecteerde dendritische cellen (DCs) tijdens antigeenpresentatie 16 vangen. T-cel bacteriële capture door transinfection buitengewoon effectiever (1,000-4,000x) dan directe infecties. T-cellen capture pathogeen en niet-pathogene bacteriën aangeeft dan transinfection is een proces gedreven door T-cellen. Opvallend transinfected T (Tit) cellen snel doodde de gevangen bacteriën en deed dat efficiënter dan professionele fagocyten 16. Deze resultaten, die een dogma van de immunologie breken, blijkt dat de cellen van adaptieve immuniteit functies die zogenaamd exclusief de aangeboren immuniteit waren kunnen uitvoeren. Bovendien toonden wij aan dat tit cellen scheiden grote hoeveelheden pro-inflammatoire cytokines en tegen bacteriële infecties in vivo.
Hier presenteren we de verschillende protocollen die worden gebruikt om de bacteriële transinfection proces bestudereneen muismodel. Dit model is gebaseerd op het gebruik van CD4 + T-cellen uit transgene muizen OTII, die een TCR specifiek voor peptide 323-339 van OVA (OVAp) in het kader van I-Ab 17 die specifieke interactie met bacteriën geïnfecteerde bot aangebracht marrow- afgeleide DCs (BMDCs) 18,19 geladen met OVAp, de vorming van een stabiele immuunsysteem synapsen.
T-cel transinfection kunnen worden gevisualiseerd en gevolgd met behulp van fluorescentie microscopie. Bovendien kan flowcytometrie worden gebruikt voor het detecteren van geïnfecteerde cellen door gebruik te maken van de fluorescentie geëmitteerd door bacteriën tot expressie groen fluorescerend eiwit (GFP) 16,20. Bovendien kunnen T-cel transinfection worden gekwantificeerd door een gevoeliger benadering de gentamicine survival test die meting van een groot aantal events mogelijk maakt. Gentamicin is een antibioticum dat eukaryote cellen niet kunnen binnendringen. Daarom is het gebruik van dit antibioticum maakt differentiatie van intracellulaire bacteriën die het antibioticum toevoeging fr overleefdOM extracellulaire degenen die werden gedood 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
T-cellen of T-lymfocyten een soort leukocyten die een centrale rol in celgemedieerde immuniteit speelt en behoren tot de adaptieve immuunrespons 26. T-cellen zijn ongevoelig voor besmetting in vitro maar sommige rapporten geven aan dat ze kunnen worden geïnfecteerd in vivo 14,15. Het intieme contact van APC en T-cellen tijdens immunologische synaps dienen als platforms voor de uitwisseling van biologisch materiaal 13, zoals sommige virussen zoals HIV 11. Rec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
Materials
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |
Riferimenti
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. . Molecular biology of the cell. , (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. . Medical Phisiology. , (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D’Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., Coligan, J. E. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
