Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas
Summary
Aquí se presenta un protocolo para medir la captura bacteriana por las células T CD4 + que se produce durante la presentación de antígenos a través de transinfection de células dendríticas infectadas previamente (DC). Mostramos cómo realizar los pasos necesarios: el aislamiento de pilas, la infección de la formación de conjugado de células DC, DC / T, y la medición de bacterias transfección de células T.
Abstract
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Introduction
Cuando un patógeno infecta a su huésped, por lo general hay una activación de la respuesta inmune innata y adaptativa, necesarios para la eliminación de bacterias. La inmunidad innata es la primera línea de defensa que impide que la mayoría de las infecciones. La inmunidad innata distinguir en unos elementos precisos manera que se conservan entre grandes grupos de microorganismos (patrones moleculares asociados a patógenos, PAMP) 1. Los mecanismos de la inmunidad innata incluyen barreras físicas tales como la piel, las barreras químicos (péptidos antimicrobianos, la lisozima) y los leucocitos innatos, que incluyen los fagocitos (macrófagos, neutrófilos y células dendríticas), mastocitos, eosinófilos, basófilos y células asesinas naturales 2. Estas células identificar y eliminar los agentes patógenos, ya sea atacando a través de contacto o mediante fagocitosis, que incluye patógenos que envuelve y matando. Este sistema no permite la defensa de toda la vida, en contraste con la inmunidad adaptativa, que confieren memoria inmunológica contra pathogens. El sistema inmune adaptativo es la segunda línea de defensa y es capaz de reconocer y reaccionar a los antígenos específicos de microbios múltiple y sustancias no microbianas 3. Los principales componentes del sistema inmune adaptativo son los linfocitos, que incluyen células B y T. Las células B están involucrados en la respuesta humoral, secretoras de anticuerpos contra agentes patógenos o proteínas exógenas. Sin embargo, las células T representan la inmunidad mediada por células, la modulación de la respuesta inmune con la secreción de citoquinas o matar las células infectadas por patógenos 4.
Células presentadoras de antígenos (APC), incluyendo células dendríticas o macrófagos, componentes del sistema inmune innato, pueden reconocer patógenos fagocitan y componentes bacterianos proceso en antígenos, que se presentan en la superficie celular por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) 5.7. Después de APC han fagocitado patógenos, por lo general migran a los ganglios linfáticos de drenaje, donde interactúan con Tlas células. Linfocitos T pueden reconocer los complejos de péptido-MHC específicos por sus receptores de células T. La sinapsis inmune (IS) se produce en la interfaz entre una APC cargadas con antígeno y un linfocito durante la presentación de antígenos 8,9. Algunas bacterias pueden sobrevivir fagocitosis y difundir sistemáticamente dentro APC. En este punto de vista, las CPA infectadas sirven como reservorios de bacterias o "caballos de Troya" que facilitan la propagación de bacterias 10. El contacto íntimo entre APC y los linfocitos que tienen lugar durante el curso de la formación es también funcionan como una plataforma para el intercambio de parte de las membranas, material genético y los exosomas y puede ser secuestrado por algunos virus para infectar las células T; este proceso se llama transinfection 11-13.
Algunas bacterias patógenas (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica y Shigella flexneri) son capaces de invadir los linfocitos T in vivo y modificar su comportamiento 14-16 de. Tenemosdescriben recientemente que los linfocitos T también son capaces de capturar las bacterias por transinfection a partir de células dendríticas infectadas previamente (DCs) durante el curso de la presentación del antígeno 16. Células T de captura bacteriana por transinfection excesivamente más eficaz (1,000-4,000x) que las infecciones directos. T patógeno captura de las células y las bacterias no patógenas que indica que transinfection es un proceso impulsado por las células T. Sorprendentemente, transinfected T (TIT) células murieron rápidamente las bacterias capturadas y lo hicieron más eficiente que los fagocitos profesionales 16. Estos resultados, que se rompen un dogma de la inmunología, muestran que las células de la inmunidad adaptativa pueden realizar funciones que eran supuestamente exclusiva de la inmunidad innata. Además, se demostró que las células Tit secretan grandes cantidades de citoquinas pro-inflamatorias y protegen de las infecciones bacterianas en vivo.
Aquí se presentan los diferentes protocolos utilizados para estudiar el proceso transinfection bacteriana enun modelo de ratón. Este modelo se basa en el uso de células T CD4 + procedentes de ratones transgénicos otii, que llevan un TCR específico para el péptido 323 a 339 de OVA (OVAp) en el contexto de la I-Ab 17 que interactúan específicamente con el hueso bacteriana infectada marrow- DCs derivadas (18,19) BMDCs cargados con OVAp, formando sinapsis inmunes estables.
Transinfection células T puede ser visualizado y rastreado mediante microscopía de fluorescencia. Además, la citometría de flujo se puede utilizar para la detección de células infectadas mediante el aprovechamiento de la fluorescencia emitida por las bacterias que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) 16,20. Por otra parte, transinfection de células T se puede cuantificar mediante un enfoque más sensible, el ensayo de supervivencia de gentamicina que permite la medición de un gran número de eventos. La gentamicina es un antibiótico que no puede penetrar las células eucariotas. Por lo tanto, el uso de este antibiótico permite la diferenciación de bacterias intracelulares que sobrevivió a la fr Además antibióticolos extracelulares om que fueron asesinados 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Células T o linfocitos T son un tipo de leucocitos que juegan un papel central en la inmunidad mediada por células y que pertenecen a la respuesta inmune adaptativa 26. Las células T son refractarios a ser infectados in vitro pero algunos informes indican que pueden ser infectados in vivo 14,15. Los contactos íntimos de células APC y T durante la sinapsis inmune sirven como plataformas para el intercambio de material biológico 13, incluyendo algunos virus como el …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
Materials
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |
Riferimenti
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