हम एक तीन आयामी खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का इस्तेमाल करता है जो एक आंख में जलन परीक्षण विकसित किया है। परीक्षण नेत्र अड़चन और संक्षारक सामग्री (जीएचएस श्रेणियाँ 1 और संयुक्त 2) और लेबलिंग (जीएचएस कोई श्रेणी) की आवश्यकता नहीं है कि उन लोगों के बीच भेदभाव करने में सक्षम है।
यूरोपीय संघ के सौंदर्य प्रसाधन निर्देशक और यूरोपीय संघ पहुंच कानून को सातवाँ संशोधन के साथ पालन करने के लिए, आदमी में नेत्र विषाक्तता के विश्वसनीय और सटीक आकलन के लिए मान्य गैर पशु वैकल्पिक तरीकों की जरूरत है। इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम एक आंख में जलन परीक्षण सामान्य मानव कोशिकाओं पर आधारित है कि एक तीन आयामी खंगाला मानव कॉर्निया की तरह उपकला (RHCE) ऊतक मॉडल का इस्तेमाल करता है जो (ईआईटी) विकसित किया है। ईआईटी नेत्र परेशानी और corrosives (जीएचएस श्रेणियाँ 1 और 2 संयुक्त) और लेबलिंग (जीएचएस कोई श्रेणी) की आवश्यकता नहीं है कि उन लोगों को अलग करने में सक्षम है। परीक्षा दो अलग-अलग प्रोटोकॉल, तरल रसायन और ठोस परीक्षण के लेख के लिए एक दूसरे, इसी तरह के प्रोटोकॉल के लिए बनाया गया एक का इस्तेमाल करता है। ईआईटी भविष्यवाणी मॉडल एक जोखिम अवधि (तरल पदार्थ के लिए 30 मिनट, ठोस के लिए 6 घंटा) और एक ही ऊतक व्यवहार्यता कट ऑफ (MTT परख द्वारा निर्धारित रूप में 60.0%) का उपयोग करता है। ईआईटी 95.5 / 68.2 / और 81.8% Sens हासिल की (44 तरल पदार्थ और 39 ठोस) 83 रसायनों के लिए परिणामों के आधार परitivity / विशिष्टता और सटीकता (एस एस एंड ए) तरल पदार्थ के लिए, ठोस के लिए / 68.4 100.0 / और 84.6% एसएस एंड ए, और 97.6 / 68.3 / और समग्र एसएस एंड ए के लिए 83.1%। ईआईटी नियामक परीक्षण आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए जानवरों के इस्तेमाल के बिना तरल और ठोस रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला के नेत्र जलन संभावित वर्गीकृत करने में महत्वपूर्ण योगदान होगा। EpiOcular ईआईटी विधि टीजी 492 के रूप में ओईसीडी टेस्ट दिशानिर्देश में 2015 में लागू किया गया था।
इस तरह के सौंदर्य प्रसाधन, डिटर्जेंट, और घर क्लीनर के रूप में उपभोक्ता उत्पादों वे आंखों से संपर्क किया तो गंभीर क्षति उत्पन्न हो सकता है कि रसायनों की एक किस्म शामिल हैं। इसलिए, आंखों में जलन के लिए इन एजेंटों के परीक्षण के उपभोक्ता सुरक्षा 1 सुनिश्चित करने के लिए अमेरिका और यूरोपीय संघ नियामक एजेंसियों द्वारा आवश्यक है। मिश्रण और योगों की आंखों में जलन की क्षमता का एक आकलन भी रसायनों के परिवहन के लिए यूरोपीय संघ के सौंदर्य प्रसाधन निर्देश के तहत सौंदर्य प्रसाधन सामग्री की लेबलिंग के लिए रीच (पंजीकरण, मूल्यांकन, प्राधिकरण, और रसायन के प्रतिबंध) के साथ कानून का पालन करने के लिए एक आवश्यकता है, और के लिए कीटनाशकों और घरेलू उत्पादों 2 की लेबलिंग। वर्तमान में, नियामक एजेंसियों के वर्गीकरण और रसायन की लेबलिंग (जीएचएस) 3 की वैश्विक स्तर पर संगत प्रणाली का उपयोग कर आंख का जोखिम मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। जीएचएस मुख्य रूप से Draize आंखों में जलन परीक्षण पर आधारित है, सबसे अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल आंखों में जलन परख जिसमें विदेशी तत्वों और मीलxtures खरगोश आंख 4 की नेत्रश्लेष्मला थैली में सीधे पेश कर रहे हैं। जीएचएस वर्गीकरण के अनुसार, जीएचएस श्रेणी 1 (नेत्र corrosives) आँखों ऊतकों या जोखिम 3,5 निम्नलिखित 21 दिनों के भीतर पूरी तरह से प्रतिवर्ती नहीं है, जो आंख और दृष्टि को गंभीर क्षति के लिए गंभीर प्रारंभिक चोट के कारण रसायन है कि परीक्षण करने के लिए संदर्भित करता है। जीएचएस श्रेणी 2 जोखिम के 21 दिनों के भीतर पूरी तरह से प्रतिवर्ती हैं कि आंख में महत्वपूर्ण परिवर्तन का उत्पादन है कि रसायनों का परीक्षण करने के लिए संदर्भित करता है। Corrosives या परेशानी नहीं कर रहे हैं कि टेस्ट रसायनों जीएचएस कोई श्रेणी के रूप में करने के लिए भेजा जाता है।
40 से अधिक वर्षों के लिए, Draize खरगोश नेत्र परीक्षण अपनी reproducibility की कमी है, मानव प्रतिक्रियाओं की overestimation, और जीवित पशुओं 5-8 के उपयोग के लिए आलोचना की गई है। इन चिंताओं शोधन, कमी है, और इन विवो परीक्षण 9 के प्रतिस्थापन के लिए कई प्रस्तावों को प्रोत्साहित किया है। मान्य गैर पशु विकल्पों की आवश्यकता के आगे मजबूत बनाया गया था(2009 में) प्रसाधन सामग्री (2005 में) कॉस्मेटिक उत्पादों की सुरक्षा के मूल्यांकन में जानवरों के इस्तेमाल पर प्रतिबंध लगा दिया है, जो निर्देशक, और सामग्री के लिए सातवाँ संशोधन की गोद से 2।
1996 के बाद से खंगाला कॉर्निया की तरह ऊतक मॉडल व्यापक रूप से कच्चे माल, पृष्ठसक्रियकारक आधारित योगों की जलन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए कॉस्मेटिक उद्योग द्वारा इस्तेमाल किया है, और में इस्तेमाल के लिए तैयार कर रहे हैं कि मिश्रण पैदा हो गई, या, आंख के आसपास के क्षेत्र में की गई है 10-13। RHCE ऊतक मॉडल के उपयोग के अपने मूल, undiluted रूप में ऊतक सतह पर परीक्षा सामग्री का सीधा सामयिक आवेदन की अनुमति देता है। इस रास्ते में, गैर-पानी में घुलनशील योगों सॉल्वैंट्स के साथ उन्हें गिराए बिना परीक्षण किया जा सकता है। एक व्यापक रूप से लागू सीधा, और आर्थिक विधि के लिए अनुरोध (वैकल्पिक तरीकों के सत्यापन के लिए यूरोपीय संघ के संदर्भ प्रयोगशाला यूरोपीय केन्द्र) EURL ECVAM की प्रतिक्रिया के रूप में आंखों में जलन टेस्ट (ईआईटी) एक singl इस्तेमाल करता है जोई जोखिम समय और लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है कि सामग्री से नेत्र परेशानी और corrosives अलग करने में सक्षम है (चित्रा 1) 14 विकसित किया गया था। 83 रसायन (44 तरल पदार्थ और 39 ठोस) के लिए परिणामों के आधार पर, ईआईटी 95.5 / 68.2 / और 81.8% संवेदनशीलता / विशिष्टता और सटीकता (एस एस एंड ए) तरल पदार्थ के लिए, ठोस के लिए 100.0 / 68.4 / और 84.6% एसएस एंड ए, और 97.6 / हासिल की 68.3 / और समग्र एसएस एंड ए के लिए 83.1%।
2007 में, EURL ECVAM के तत्वावधान में प्रसाधन सामग्री यूरोप (पूर्व में Colipa) द्वारा प्रायोजित एक बहु प्रयोगशाला पूर्व सत्यापन अध्ययन औपचारिक सत्यापन 15 को लाने के लक्ष्य के साथ ईआईटी की प्रासंगिकता और विश्वसनीयता का आकलन किया। इस अध्ययन में, 298 स्वतंत्र परीक्षणों सात स्वतंत्र प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया गया। अध्ययन के परिणाम भाग लेने वाले सभी प्रयोगशालाओं 15 के पार भिन्नता के कम गुणांक के साथ भविष्यवाणी में 99.7% समझौते का प्रदर्शन किया। नतीजतन, 2010 में ईआईटी प्रोटोकॉल एक औपचारिक EURL ECVAM में प्रवेश कियासत्यापन कार्यक्रम। सत्यापन के अध्ययन में विवो संदर्भ डेटा (Draize आंखों में जलन डेटा) उपलब्ध थे, जिसके लिए अलग-अलग पदार्थों और रासायनिक मिश्रण, सहित 104 कोडित परीक्षण रसायन, का उपयोग किया। इस काम की सफलता के आधार पर, एक ओईसीडी मसौदा परीक्षण दिशानिर्देश यह ईआईटी संयुक्त राष्ट्र जीएचएस वर्गीकरण और लेबलिंग प्रणाली के अनुसार सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के नेत्र जलन क्षमता का वर्गीकरण में महत्वपूर्ण योगदान होगा अनुमान है कि 2014 में प्रस्तुत की गई थी।
हम EpiOcular ऊतक मॉडल के लिए विकसित किया गया था कि आंखों में जलन टेस्ट (चित्रा 1) प्रस्तुत किया है। जीएचएस श्रेणी के बीच भेदभाव नहीं करता है इस के साथ साथ के रूप में प्रस्तुत ईआईटी संवेदनशीलता और विशिष्टता 17. ईआईटी की उच्च डिग्री के साथ लेबलिंग (जीएचएस कोई श्रेणी) की आवश्यकता नहीं है कि सामग्री से नेत्र परेशानी और corrosives (जीएचएस श्रेणियाँ 1 और 2 संयुक्त) को अलग करने में सक्षम है 1 श्रेणी से 2 रसायनों। ईआईटी वर्गीकरण और कॉस्मेटिक और दवा सामग्री सहित रसायनों की एक विस्तृत श्रृंखला के नेत्र जलन संभावित की लेबलिंग के लिए मान्य किया गया था। इन विट्रो परीक्षणों में दूसरे के साथ संयोजन के रूप में, ईआईटी इन विवो खरगोश आंखों में जलन की परीक्षा के लिए एक स्थानापन्न के रूप में काम करेगा।
ईआईटी जोखिम और बाद जोखिम ऊष्मायन अवधि (चित्रा 1) की लंबाई में भिन्न है जो तरल और ठोस सामग्री, के लिए दो समान है लेकिन अलग प्रोटोकॉल का उपयोग करता है। ईआईटी में इस्तेमाल समापन बिंदुपहले से मान्य मानव उपकला ऊतक मॉडल 20,21 में इस्तेमाल किया गया है जो MTT परख द्वारा निर्धारित ऊतक व्यवहार्यता है। इस परख करने के लिए, मानक सेल संस्कृति उपकरणों के अलावा कोई विशेष उपकरणों की जरूरत है। कारण उच्च ऊतक-से-ऊतक reproducibility के स्तर, एन = 2 ऊतकों के बजाय करने के लिए आमतौर पर की सिफारिश एन = 3 इस्तेमाल कर रहे हैं। क्षमता n का उपयोग करने के लिए = यह कारण व्यक्ति के ऊतकों 14 की अलग से निपटने के लिए इस तरह पैदा कर सकते हैं कि परख की परिवर्तनशीलता को कम करने, एक अनुभवी ऑपरेटर एक साथ दो ऊतकों पर कार्रवाई करने के लिए अनुमति देता है के बाद से 2 ऊतकों, प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू है। इसके अलावा, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ-साथ परीक्षा लेख के अनुसार एन = 2 ऊतकों, एक ही शारीरिक राज्य (तरल या ठोस) के 10 परीक्षण पदार्थों की खीज का उपयोग करके, एक किट (24 ऊतकों) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है।
सामग्री के विश्वसनीय वर्गीकरण सुनिश्चित करना है कि अन्य महत्वपूर्ण बिंदुओं पर सकारात्मक नियंत्रण सु के लिए विनिर्देशों हैंbstance (ऊतक व्यवहार्यता ≤50.0%), डुप्लिकेट ऊतकों (अंतर <20.0%), और नकारात्मक नियंत्रण आयुध डिपो रीडिंग (> 0.8 और <2.5) के बीच reproducibility।
ईआईटी परीक्षण जब प्रदर्शन ऊष्मायन अवधि में प्रोटोकॉल या परिवर्तन से विचलन बदल परिणाम में परिणाम हो सकता है के बाद से, यह मान्य प्रोटोकॉल के लिए और सुझाव खुराक के लिए और rinsing कार्यक्रम (टेबल्स 3 और 4) पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसी तरह, MTT ऊष्मायन के लिए 3 घंटा समय से विचलन अलग MTT रीडिंग में परिणाम होगा और परख परिणाम को प्रभावित कर सकता है।
कभी कभी, एक परीक्षण रासायनिक MTT ऊतक व्यवहार्यता परख या MTT के कारण कमी के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो ऑप्टिकल या अन्य संपत्तियों के लिए हो सकता है। उदाहरण के लिए, एक परीक्षण रासायनिक सीधे नीले, बैंगनी प्रतिक्रिया उत्पाद में MTT कम कर सकते हैं, या MTT formazan (~ 570 एनएम) के रूप में एक ही श्रेणी में प्रकाश को अवशोषित कर लेता है कि एक रंग का पदार्थ हो सकता है। हालांकि, इन परीक्षण रसायनों जनसंपर्क होगाMTT परख के समय, सामग्री की एक पर्याप्त राशि अभी भी ऊतक पर उपस्थित (या द्वारा अवशोषित) है, तो केवल एक समस्या ESENT। इस हस्तक्षेप से बचने के लिए, व्यापक rinsing प्रक्रियाओं ईआईटी प्रोटोकॉल में शामिल कर रहे हैं। टीए को दूर नहीं करता rinsing और टीए MTT कमी के साथ हस्तक्षेप करते हैं, तो अतिरिक्त नियंत्रण का पता लगाने के लिए किया जाता है और इसके लिए सही किया जाना चाहिए। परीक्षण रसायन के प्रत्यक्ष MTT कमी संदेह है कि अगर संक्षेप में, सवाल में रसायन के 50 μl (या ठोस के लिए 50 मिलीग्राम) एससीसी (नेकां, बाँझ विआयनीकृत पानी की 50 μl पर काम कर रहे MTT समाधान के साथ 3 घंटे के लिए incubated है, होना चाहिए ) साथ-साथ चलेंगी। MTT समाधान नीले, बैंगनी बदल जाता है, परीक्षण लेख MTT कम कर दिया है माना जाता है। इस मामले में फ्रीज मारे गए ऊतक नियंत्रण का उपयोग कर एक कार्यात्मक की जांच परीक्षा सामग्री ऊतक के लिए बाध्य है और एक झूठी MTT कमी के संकेत के लिए अग्रणी है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए किया जाना चाहिए। टीए-अवगत कराया, मारे गए ऊतक नियंत्रण में प्रशंसनीय MTT कमी नहीं है, तो(इलाज व्यवहार्य ऊतक में राशि के सापेक्ष), परीक्षण लेख का मतलब ऊतक व्यवहार्यता मारे गए नियंत्रण का मतलब व्यवहार्यता को घटा कर सही किया जाना चाहिए।
नकारात्मक झूठी वर्गीकरण 14,15,18 की कम भार द्वारा प्रदर्शन के रूप ईआईटी, सुरक्षा के पक्ष में errs। महत्वपूर्ण बात है, आंख के लिए संक्षारक कर रहे हैं और जो जीएचएस श्रेणी 1 रसायन, में से कोई भी, सबसे गंभीर नेत्र खतरा प्रतिनिधित्व इस परख 14,15,18,19 में गैर परेशान के रूप में वर्गीकृत किया गया है। अंत में, इन विट्रो परीक्षा पद्धति में RHCE का प्रमुख लाभ में से एक साफ तरल और (दो आयामी, जलमग्न सेल संस्कृतियों के साथ संभव नहीं है) ठोस सामग्री के परीक्षण की संभावना है।
ईआईटी संयुक्त राष्ट्र जीएचएस वर्गीकरण और लेबलिंग प्रणाली के अनुसार सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के नेत्र जलन क्षमता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण योगदान होगा। जानवरों के प्रतिस्थापन ओ निर्धारित करने के लिएcular विषाक्तता कई वर्षों के लिए विषाक्तता अनुसंधान के एक लक्ष्य दिया गया है। ईआईटी परीक्षण विधि 2014 में EURL ECVAM द्वारा समर्थित एक औपचारिक मान्यता के अध्ययन पूरा कर लिया है और EpiOcular ईआईटी 2015 में ओईसीडी टीजी 492 के रूप में ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश में लागू किया गया था।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ईआईटी परियोजना के लिए समर्पित उनकी वैज्ञानिक समर्थन और समय के लिए डॉ जॉन Harbell को धन्यवाद देना चाहूंगा। लेखकों को भी, Beiersdorf एजी (जर्मनी), IIVS (यूएसए), मरियम Kay इंक (यूएसए), एवन उत्पाद इंक (यूएसए), प्रोक्टर एंड गैंबल / Cosmital (स्विट्जरलैंड), Laboratoire पियरे fabre (फ्रांस) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं हरलन लेबोरेटरीज (यूनाइटेड किंगडम), और आंखों में जलन टेस्ट 15 की बहु केंद्र इंटरनेशनल पूर्व मान्यता और मान्यता के अध्ययन में भाग लेने के लिए एलवीएमएच parfume (फ्रांस)।