Introduction
目前考虑的颅颌面(CMF)骨缺损治疗的金标准,收获的自体移植的移植是由复杂的移植手术,供体部位发病率和有限1阻碍。一个特别困难被整形并紧紧固定在刚性移植到缺陷,以获得骨整合和预防移植物吸收。组织工程已被调查作为一种替代战略,以自体移植和人工合成骨替代品( 如骨水泥)2,3。关键的组织工程方法的成功是一组特定属性的支架。第一,为了实现骨整合,支架必须形成与相邻的骨组织4紧密接触。该支架也应该是骨传导,允许细胞迁移,营养扩散和neotissue沉积4,5。这种行为通常是实现了与可生物降解的SCAffolds表现出高度互联的孔结构。最后,该支架应的生物活性,以促进融合和粘接与周围骨组织5。
在这里,我们提出了一个协议,准备组织工程支架具有这些属性。重要的是,这种支架显示能力的“自我适应”到,由于其形状记忆行为6不规则的CMF缺陷。温敏形状记忆聚合物(SMP系统)是已知的在暴露于经受形状改变以加热7,8。中小事务所是由“netpoints”(即化学或物理交联),这决定了永久的形状和“转换段”,它保持暂时形状,并恢复永久的形状。开关段表现出相应于任一所述的玻璃化转变(T 克 )热转变温度(T 反式)或熔融聚合物的转变(Tm值)。由于其结果,污水收集可以顺序变形为暂时形状在T> T 反式,在T <T 反式固定在暂时形状,并恢复到在T> T 反式的永久形状。因此,SMP支架可以实现“自我装配”中的CMF缺陷如下6。曝光后,以温盐水(T> T 转 ),一个SMP支架将成为延展性,允许一个一般制造的圆筒状的支架是用手压成不规则的缺陷,具有形状恢复促进扩大脚手架的缺陷边界。在冷却(T <T 反式),脚手架将回到其相对更为刚性的状态,具有形状固定性保持缺陷在其新的临时形状。在这个协议中,将SMP支架选自聚己内酯(PCL)中制备,可生物降解的聚合物广泛研究的组织再生和其它生物医学应用9-11。对于形状记忆,日PCL电子Tm值用作经t 反式和43之后60°C之间变化,取决于在PCL 12的分子量。在这个协议中,支架的Ť 反式 (即Tm值)是56.6±0.3ºC6。
为了达到骨传导性,协议的开发,使PCL基的SMP支架与基于溶剂的铸造颗粒淋(SCPL)方法6,13,14高度互连的孔。聚己内酯丙烯酸酯(PCL-DA)(Mn为=〜10,000g / mol的)得到使用,以允许快速,光化学交联和溶解于二氯甲烷(DCM),以允许溶剂浇铸在盐模板。以下光化学固化和溶剂蒸发,盐模板除去浸出到水中。平均盐大小调节支架孔径。重要的是,该盐模板融合用水之前溶剂浇铸实现孔隙interconnectiviTY。
生物活性传授给了SMP的支架原位形成聚多巴胺涂到孔壁6。生物活性通常通过包含玻璃或玻璃-陶瓷填料15引入到支架。但是,这些可能引起不必要的易碎的机械性能。多巴胺已经显示,以形成对各种基材16-19中粘附,薄聚多巴胺层。在这个协议中,将SMP支架进行多巴胺的弱碱性溶液(pH = 8.5),以形成聚多巴胺的所有孔壁表面6 nanothick涂层。除了 增强表面的亲水性以改进细胞粘附和传播,聚多巴胺已被证明是生物活性在形成的羟基磷灰石(HAP)在暴露于模拟体液(SBF)18,20,21的条款。在最后的步骤,将涂覆的支架被暴露在85℃(T>Ť 反式)的wh热处理ICH导致脚手架致密化。热处理是前面提到的是为支架的形状记忆行为所必需的,或许是由于PCL结晶 区域重组,以更接近14。
我们另外描述的方法中的不规则缺陷模型的自装配行为表征,形状记忆行为而言 应变控制环状热机械压缩试验(即形状恢复和形状固定性),孔的形态,并在体外生物活性 。策略定制支架性能也提出了。
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Protocol
1.合成PCL-DA大分子单体
- 运行丙烯酸酯化反应。
- 重20克的PCL二醇(Mn为=〜10,000g / mol的)的成250ml圆底烧瓶装配有聚四氟乙烯覆盖的磁力搅拌棒。
- 化解PCL二醇在DCM。
- 添加120 mLlof DCM至烧瓶(浓度= 0.17克/毫升)。
- 放置一个橡胶隔膜松散到烧瓶的颈部,以避免压力积聚,同时也防止DCM中蒸发。
- 在〜250rpm下为约30分钟搅动溶液以完全溶解聚合物。
- 添加〜6.6毫克的4-二甲基氨基吡啶(DMAP)到溶液中,溶解并搅拌。
- 放置一个橡胶隔膜牢固地插入烧瓶颈部。让溶液继续搅拌。
- 通过橡胶隔膜,轻轻用正的 N 2压力针入口和一开放针吹扫烧瓶用N 2〜3分钟作为出口。
- 取出N 2入口和出口。
- 通过配备有穿过橡胶隔片插入一针的玻璃注射器添加0.56毫升(4.0毫摩尔)三乙胺(的Et 3 N)的溶液。
- 通过配备有穿过橡胶隔片插入一针的玻璃注射器添加0.65 ml的丙烯酰氯滴加(8.0毫摩尔)。
- 返回的 N 2入口到烧瓶中,并允许内容物在正N 2压力搅拌〜30分钟。
- 预加热的油浴至55ºC。
- 所分配的〜30分钟后,除去N 2入口和有冷凝器替换隔膜。
- 淹没烧瓶到预加热的油浴中。
- 允许烧瓶的内容物搅拌20小时。
- 所分配的20小时后,除去从油浴中的烧瓶中,并允许内容物冷却至室温。
- 使用旋转蒸发器,从烧瓶中除去DCM溶剂。
- Purify粗PCL-DA产品。
- 向该烧瓶中,添加〜135毫升乙酸乙酯和溶解粗的PCL-DA。
- 重力过滤通过滤纸将溶液倒入干净250ml圆底烧瓶中。 (注:溶液可增稠在滤纸上,不容易穿过如果是这样,仔细地施加温和热用加热枪。)
- 使用旋转蒸发器,除去乙酸乙酯从烧瓶溶剂。
- 向该烧瓶中,添加140〜毫升DCM并溶解粗的PCL-DA。
- 传送内容至500ml分液漏斗中。
- 到漏斗中,添加13.5毫升2M碳酸钾(K 2 CO 3)。
- 盖上漏斗。轻轻倒置漏斗和打旋轻轻一次或两次,照顾经由旋塞以释放压力混合两层。重复3次。
- 替换用一层石蜡膜的盖,并允许该混合物分离O / N(〜12小时)。
- 收集底部或加尼奇层放入250毫升锥形瓶中。
- 添加〜5克无水硫酸镁( 硫酸镁 )到烧瓶中,轻轻地旋转。
- 重力过滤通过定性滤纸和到一个干净的250ml圆底烧瓶中的混合物。
- 使用旋转蒸发器,从烧瓶中除去DCM溶剂。
- 在高真空下干燥,以除去残留的DCM。 (注:PCL-DA应避光保存。)
- 确认丙烯酸化用 1 H-NMR 22,23。
2.准备SMP脚手架(图1)
- 制备熔盐模板。
- 使用425微米的筛子,直径获得的氯化钠(盐)颗粒〜460±70微米。 (注:平均粒径可以由扫描电子显微镜[SEM]图片包含的ImageJ软件确认。)14
- 向3毫升的玻璃小瓶(ID = 12.9Hz MM),添加1.8克本预先过筛的NaCl。
- 慢慢添加,分四份,7.5重量%(基于重量盐)去离子水(0.146克)到小瓶中。混合通过加入水每个部分的后一个金属刮刀。
- 帽小瓶中,包裹在组织和放置垂直插入一个离心管中。离心15分钟,在3220×g下。
- 取下盖子,让空气干燥O / N(〜12小时)。
- 在一个新的玻璃小瓶,准备了“单体溶液”相结合,0.15克每毫升DCM的PCL-DA的。 (注意:对于一种脚手架,〜1毫升溶液应制备)盖上盖子并混合溶液在高速在涡旋混合器上为约1分钟。
- 在一个新的3毫升玻璃小瓶中,准备基于10重量%的2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMP)中的1-乙烯基-2-吡咯烷酮(NVP)一个“光引发剂溶液”。结合0.115克DMP在1ml的NVP。 (注:其一支架,〜180微升是必需的。)帽,包装在铝箔(阻挡光)和混合解决方案,在高速上的旋涡混合器对于〜1分钟。 (注意:如果在先进制备,该溶液应冷藏并避光。)
- 包裹含有大分子单体溶液(不包括帽)用铝箔小瓶(方框光),并通过移液管添加15体积%(基于大分子单体溶液的总体积)的光引发剂的溶液。盖上盖子并混合溶液在高速在涡旋混合器上为约1分钟。
- 用铝箔包装含有熔融盐模板(不包括帽)小瓶(方框光),并通过移液管添加预先制备的大分子单体/引发剂溶液(〜0.6 ml或直到模板被完全覆盖)。
- 帽小瓶中,包裹在组织和放置垂直插入一个离心管中。离心10分钟,在1260×g离心来分发整个模板的大分子单体溶液。
- 取下铝箔,开盖小瓶并暴露于UV光(365纳米,25瓦)下3分钟。风干O / N。
- 删除“含盐的scaffol从具有得分和压裂玻璃瓶后上方镊子小瓶D“。
- 在400毫升烧杯中,准备约200毫升水/乙醇溶剂(1:1体积:体积)。
- 保持浸没在水/乙醇溶剂4天每日溶剂改变该支架。
- 取下溶剂,空气干燥O / N的支架。
3.应用聚多巴胺涂层以SMP脚手架(图1)
- 在400毫升烧杯中装配有聚四氟乙烯覆盖搅拌棒,准备约200毫升的盐酸多巴胺溶液(在10mM Tris缓冲液2毫克/毫升,pH值= 8.5,25℃)。在搅拌〜150转。
- 一半的距离通过该支架到所述支架,〜;放置一个一次性针(表= 20长度= 40毫米)。环绕所述针毂的线材。
- 由锚定线到烧杯的边缘淹没该支架(与溶液表面上方的针毂)加入搅拌中的多巴胺溶液。
- 通过将注射器插入针毂,并用它拉空气从支架的脱气脚手架。 (注:除气完成时,没有更多的空气可以被除去,该溶液已完全渗入该支架。)
- 保持浸没在16小时的搅拌多巴胺溶液中的脚手架。
- 从溶液中除去所述支架和取出针。用DI水和干燥,在真空烘箱中在室温放置24小时冲洗。
- 放置在一个85ºC烘箱该支架1小时。
- 让脚手架冷却至室温。最终的圆柱形支架会〜6毫米直径×约5毫米的高度。
4.评估“自我装配”行为
- 制作“不规则CMF缺陷模型”使用硬质塑料,其厚度为约5毫米的片材。使用钻头来创建塑料片内的空隙,平均直径大于〜6毫米略少,这表现在图2A中。
- 在AB埃克,热DI水(相当于本临床使用生理盐水)至〜60℃的高温。
- 放置支架到烧杯〜60ºC水。使用镊子推水面下的脚手架,露出所有区域到水中。继续为〜2分钟或直到支架是明显软化( 图2B)。
- 取下烧杯中的脚手架,并立即按下(手动)到模型的缺陷。
- 允许冷却至室温(〜5-10分钟)(图2C)。
- 从缺陷除去以观察新的,固定的临时形状和相对更刚性的状态(图2D)的返回。
5.测试形状记忆行为
- 使用动态机械分析仪(DMA;例如TA仪器Q800如本文所用),运行在支架一个应变控制环状热机械压缩测试超过两个周期(N),来确定形状固定性(R f)和形状恢复(R R)( 图3)。
- 平衡至60℃(T 高 )5分钟。
- 压缩到最大应变(ε 米 = 50%)以50%/分钟。
- 保持在ε 米(5分钟)。
- 冷却至25℃(T 低 ),并保持10分钟以固定暂时形状。
- 除去负载。
- 测量在无压力状态下的极限应变(εU)。
- 再加热至60℃(T 高 ),并且维持10分钟,以恢复永久形状。
- 测量回收的应变(εp)的 。
- 同时仍然在60℃(T 高 ),由支架压缩到第 1次循环后回收的高度(N = 1)的50%开始第 2次循环(2 N =)。
- 重复5.1.3-5.1.8对于N = 2。
- 使用以下公式计算R f和R r表示 ,N = 1和2:
的 R F(N)= [εU(N)/εM] R R(N)= [ε 米- εP(N)] / [ε 米- εP(N-1)]
6,可视化孔径和孔互连性
- 使用扫描电子显微镜(SEM;例如一个FEI广达SEM如本文所用),观察孔径和孔互连性。
- 利用镊子以保持SMP支架,淹没在液体N 2 1分钟。
- 从液体的 N 2和断裂以及一个干净的刀片支架的中间除去。
- 使用碳纤维带,加盖SMP支架半一到样品舞台断裂面朝上。
- 溅射涂层与金铂(〜4纳米)。
- 捕获SEM图像在10-15千伏(图4A)推荐的加速电压。
7.测试其体外生物活性的
- 到50毫升离心管中,加入约30毫升1X SBF 24。
- 获得在其原始的,圆筒状成型永久形状的支架。切用干净的刀片一半的支架(跨圆边)。
- 放置一个单独的支架一半到准备好的离心管和帽。
- 保持所述管在37℃下在无SBF更改静态条件下的水浴。
- 14天后,取出从SBF和空气干燥的支架24小时。
- 使用碳纤维带,加盖支架上的断裂面朝上的样品台。
- 溅射涂层与金铂(〜4纳米)。
- 捕获的SEM图像在重赞扬10-15千伏( 图4B)加速电压。
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Representative Results
将所得的PCL基SMP支架是能够自我装配到一个模型CMF缺陷(图2)的。短暂暴露后温热盐水(〜60℃),圆柱形支架软化允许支架进行手动压入并展开模型缺损内。冷却至RT后,支架被固定到被从缺陷保留在除去其新的临时形状。
一个SMP支架材料的形状记忆行为由应变控制环状热机械压缩试验在形状固定性(R f)和形状恢复(R R)(图3)来表示定量。对于这个PCL基SMP支架,值(%)为周期N = 1和2是,R F(1)= 102.5 0.7,R F(2)= 101.8 0.3,R R(1)95.3 0.9,和R R (2)= 99.8 0.2 6。
在SMP支架显示高度互连的孔结构的观察通过SEM成像( 图4A)。这是通过使用熔融盐的模板,通过加入少量的水向筛分的盐(图1)形成的实现。
在暴露于模拟体液(SBF; 1X)14天,SEM成像证实了形成羟基磷灰石(图4B)的,从而表明支架的生物活性。
图1.示意图制备的SMP支架涂覆有聚多巴胺。ASMP支架经由基于使用溶剂浇铸微粒淋(SCPL)方法聚己内酯丙烯酸酯(PCL-DA)的光化学治疗所描述的协议制作用人熔盐模板应用生物活性聚多巴胺涂层。在85°C(T> T 反式)的最终热处理引起脚手架书房评定类别。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.观察自我装配的行为。圆柱形SMP支架(〜6毫米直径×约5毫米的高度)安装在一个“不规则的缺损模型”(A),如下所示 。在加热时在水中〜60ºC(T> T 反式),该支架软化并变得延展性(B)中 ,从而可以机械地按压(“嵌合”)的模型缺陷(C)的范围内。以下冷却至RT,将SMP支架被移除,并保留其新的,固定的临时形状(D)中 。在随后的加热在约60℃,支架经历形状恢复到原始的,通用的圆柱形状。
图3.测量的形状记忆行为。一个SMP支架材料的形状记忆特性是通过应变控制环状热机械压缩试验定量上的支架,以确定形状固定性(R f)和基于形状恢复(R r)的的ε 米的测量,εu和 ε 页。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.观察上电复位Ë互联互通和形成羟基磷灰石(HAP)的,无任何涂层,热处理SMP支架的代表性SEM图像(比例尺= 200微米)(A)和涂层,接触到SBF(1X)14天后热处理支架(比例尺= 50微米)(B)。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这个协议描述了一种聚多巴胺涂覆的,PCL-基于支架,其自入行为的制备,以及骨诱导性和生物活性,使得在不规则CMF骨缺损的治疗兴趣它。该协议的各方面可以被改变,以改变各种支架功能。
该协议开始于PCL二醇,允许UV固化的丙烯酸酯化。在所报告的实例中,PCL二醇Mn为是〜10,000g / mol的。然而,通过适当地调整丙烯酰氯量和的Et 3 N的PCL-DA了PCL二醇可以被用于减少或增加,分别交联密度较高或较低的Mn为合成期间使用。
熔盐模板是给协议(图1)的重要组成部分。平均盐大小决定了所得脚手架孔径。在所描述的例子中,平均盐大小为〜460±70&#181,M。而较小的盐大小可被利用,但是应当记住的是,所述支架在最后热处理步骤,这将降低孔径发生收缩。盐的筛分被利用来减小盐大小分布,因此,孔径分布。以产生具有高度互连的孔的支架,盐融合诱导通过加入少量的水(基于盐重量7.5重量%)。这是已知的孤立的NaCl粒子部分地溶解到连续poragen模板25,26。根据不同的平均尺寸的盐,加入水的量必须被调整14。另外,盐的融合过程中,水必须逐渐加入,机械混合,最后离心以确保其均匀分布,以及所述盐颗粒的填充。
具有形成的熔融盐模板,在PCL-DA溶于DCM为溶剂浇铸。在所描述的协议中,一个concentratioñ为0.15g每1ml DCM的PCL-DA被利用。该浓度可以增加或减少。然而,虽然增加浓度预期增加脚手架模量,它也可以产生支架具有较低的孔隙互连14。
一旦前体溶液被添加到盐模具,离心有助于助手在其扩散到模板。以下快速UV固化,空气干燥允许DCM蒸发溶剂。从模具中取出后,该支架浸泡在水/乙醇(1:1体积:体积)4天以除去盐模板。扫描电镜成像证实高度互连的孔结构(图4A)的形成。
甲聚多巴胺涂层施加到支架的孔壁上,以赋予生物活性。由于所得到的支架的收缩,最好是在最终热处理步骤6之前施加涂层。另外,脱气而在含水多巴胺溶液浸没所述支架有助于渗透。将脱气脚手架遗体浸没在溶液,以促进均匀的聚多巴胺覆盖。一旦涂布并彻底清洗,先前白支架显示聚多巴胺21的棕色颜色特性。因此,在整个支架覆盖范围可以通过视觉检查来评估通过二等分的支架来确认聚多巴胺扩散。
应用的聚多巴胺涂层后,进行最终热处理被执行(85ºC,1小时)。如所指出,这一过程会导致支架的收缩。然而,热处理是必不可少的,以更接近实现的形状记忆行为14,可能是由于在PCL结晶 区域(即切换链段)的重组。
如图2所示,SMP支架实现自我拟合模型中的缺陷,由于它的温敏塑造我MORY性质。暴露于温暖的盐水(〜60℃)在PCL的结晶域,使得软化的支架可被压入模型缺陷诱导熔化。当手动释放压力,形复苏推动扩张支架,填补不规则边界。当冷却至室温,在PCL结晶域重整,固定所述支架在其中被保留在除去来自缺陷的新的临时形状。以前,我们证实,沿着移除支架的边缘的孔仍尽管与模具6接触相当开放。
当由应变控制环状热机械压缩试验(图3),测量值理想形状记忆行为的特征在于为100%R f和R R的值。对于所描述的SMP支架,为周期1和2 的 R F值稍微> 100%6。 的 R F先前已观察到略微克食超过100%14,27由于在压缩应变时形状固定从PCL段的再结晶成更紧凑的结构27或从PCL的压缩引起的再结晶略有增加。此外,R R从周期1上升到周期2 6。在研发的R值的增加已经被前面提到的固体28,29,22和多孔的SMP 13,14,23。据认为,在第一循环期间,残余应变从处理始发除去在下一周期 7中,使得形状恢复增加。
所描述的组织工程支架达到特定的一组为成功治疗CMF骨缺损的关键特性。该支架有望通过其能力范围内的不规则CMF骨缺损“自我适应”,以促进骨结合。骨传导性是基于实现孔互连性预测以及脚手架生物降解性。最后,由于聚多巴胺涂层,支架是生物活性经由HA的形成期间在体外试验 (图4B)所指示的。这种生物活性被预测为便于集成和结合与周围骨组织。因此,该支架是替代自体移植和传统的骨替代CMF骨缺损修复。
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Acknowledgments
作者感谢得克萨斯州A与M大学工程试验站(TEES)对这项研究的财政支持。林赛指甲非常感谢来自得克萨斯州A与M大学路易斯·斯托克斯联盟少数人参与(LSAMP)和美国国家科学基金会(NSF)研究生研究奖学金计划(GRFP)的支持。张大伟感谢得克萨斯州A与M大学论文奖学金。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
Sieve | VWR | 47729-972 | |
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
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