De novo lipogenesi e acido ossidazione β-grassi costituiscono importanti vie metaboliche in epatociti, percorsi che sono perturbate in diversi disordini metabolici, tra cui malattia del fegato grasso. Qui mostriamo isolamento di epatociti primari di topo e descriviamo la quantificazione di ossidazione degli acidi β-grassi e lipogenesi.
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Articolo metodologico
Determinazione della ossidazione degli acidi grassi e la lipogenesi nel topo primaria Epatociti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il metabolismo dei lipidi nel fegato è complesso. Oltre a importare ed esportare lipidi tramite lipoproteine, gli epatociti possono ossidare i lipidi attraverso l'ossidazione degli acidi grassi o, in alternativa, sintetizzare nuovi lipidi tramite lipogenesi de novo. La somma netta di questi percorsi è dettata da una serie di fattori, che in alcuni stati patologici portano alla steatosi epatica. L'eccessivo accumulo di lipidi epatici è associato all'insulino-resistenza in tutto il corpo e alla malattia coronarica. Gli strumenti per studiare il metabolismo lipidico negli epatociti sono utili per comprendere il ruolo del metabolismo lipidico epatico in alcuni disturbi metabolici.
Nel fegato, gli epatociti regolano la degradazione e la sintesi degli acidi grassi attraverso l'ossidazione dei grassi β e la lipogenesi de novo, rispettivamente. La quantificazione del metabolismo in queste vie fornisce informazioni sulla gestione dei lipidi epatici. A differenza della quantificazione in vitro, utilizzando epatociti primari, effettuare misurazioni in vivo è tecnicamente impegnativo e richiede molte risorse. Pertanto, la quantificazione dell'ossidazione degli acidi grassi β e della lipogenesi de novo negli epatociti di topo in coltura fornisce un metodo diretto per valutare la gestione dei lipidi degli epatociti.
Qui descriviamo un metodo per l'isolamento di epatociti primari di topo, e dimostriamo la quantificazione dell'ossidazione degli acidi grassi β e della lipogenesi de novo, utilizzando substrati radiomarcati.
Introduzione
La steatosi epatica non alcolica è una delle principali cause di malattie del fegato nelle culture occidentalizzate1,2. L'accumulo di lipidi all'interno del fegato è associato a morte cellulare, fibrosi e insufficienza epatica attraverso meccanismi ancora sconosciuti3-6. Nella steatosi epatica, l'ossidazione degli acidi grassi β mediata dagli epatociti e la lipogenesi de novo sono importanti determinanti dell'accumulo netto di lipidi7,8. Questo articolo si concentrerà, quindi, sull'isolamento degli epatociti, seguito dalla quantificazione dell'ossidazione degli acidi grassi β e dalla lipogenesi de novo.
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Protocollo
Tutti sperimentazione animale deve essere effettuata in conformità con le normative locali e federali e con l'approvazione di un IACUC e radioprotezione amministrazione istituzionale.
1. Preparazione
- Alcuni giorni prima del test, scongelare il flacone da 500 ml di fegato Digest Medium (LDM) e ricongelare ~ 35 ml aliquote in 50 ml provette coniche. Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Un giorno prima del test, pre-sterilizzare strumenti di dissezione puliti in autoclave.
- Il giorno del test, trattare la quantità necessaria di piastre di coltura a 24 pozzetti con collagene.
- Mescolare ....
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Risultati
Isolamenti epatociti tipicamente risultato in 1 - 3 x 10 7 cellule totali. Dopo incubazione per una notte, le cellule appariranno esagonale, molti dei quali saranno binucleate (Figura 2). Le cellule sane dovrebbero essere privi di granulazioni o vesciche, indicativi della morte cellulare.
In generale, dosaggio di acidi grassi ossidazione viene eseguito in tre o quattro repliche per composto in esame. Conti per le CO 2 campioni sono circa un quinto di qu.......
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Discussione
Il tempo dal sacrificio perfusione deve essere inferiore a 3 minuti per perfusione ideale e collagenasi digestione del fegato. Una volta iniziata la perfusione con perfusione Media, il fegato dovrebbe cambiare immediatamente aspetto a dal rosso al pallido. Dopo circa 10 minuti di incubazione con LDM, il fegato apparirà gonfio e rosa. Nel caso in cui perfusione è insufficiente, il fegato non può presentare tali modifiche, e ciò avrà come risultato una resa minore epatociti.
Dopo le fasi di la.......
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Dichiarazioni
Gli autori indicano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Susan Gray e Umadevi Chalasani per il loro aiuto con gli aspetti tecnici del protocollo di isolamento degli epatociti. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIDDK 5R01DK089185 (a M.P. Cooper) e dal DERC Pilot and Feasibility Program presso UMMS (a M.P. Cooper).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Perfusione epatica Medium | Life Technologies | 17701038 | |
| Liver Digest Medium | Life Technologies | 17703034 | Aliquotare e conservare a -20 ° C |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10X DPBS | Corning | 46-013-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Life Technologies | 26140079 | |
| Tecnologie per la vita del collagene | A1048301 | ||
| Silice colloidale rivestita con polivinilpirrolidone | GE Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Piruvato di sodio | Cellgro | 25-000-CI | |
| Penicillina / Streptomicina | Cellgro | 30-001-CI | |
| Insulina | Sigma | I0516-5ML | |
| Desametasone | Sigma | D2915-100MG | |
| Albumina (BSA), Fraction V | MP Biomedicals | 103703 | |
| Piatto di coltura a 24 pozzetti | Corning Falcon | 353047 | |
| Tubi Tygon S3 | Cole Parmer | 06460-34 | |
| Blocco Leur maschio a 200 connettori a innesto | Cole Parmer | 45518-00 | |
| Catetere da 24 G x 3/4" | SurFlo | SROX2419CA | |
| Sutura in seta Perma-Hand | Ethicon | 683G | |
| Filtro cellulare | Corning Falcon | 08-771-2 | |
| IsoTemp 3013HD Bagno d'acqua a ricircolo | Fisher | 13-874-3 | |
| Pompa peristaltica MasterFlex C/L | MasterFlex | HV-77122-24 | |
| Microclamp | Roboz | RS-7438 | Pre-sterilizzazione in autoclave |
| 5" Forbici operative diritte, smussate-smussate | Roboz | RS-6810 | Pre-sterilizzazione in autoclave |
| Lama da 24 mm Forbici per microdissezione diritte e a punta affilata | Roboz | RS-5912 | Pre-sterilizzazione in autoclave |
| " con punta da 0,8 mm Pinze per microdissezione | Roboz | RS-5130 | Pre-sterilizzazione in autoclave |
| 4" con punta da 0,8 mm Pinze per microdissezione a curva completa | Roboz | RS-5137 | Pre-sterilizzare in autoclave |
| Siringa da 60 ml | Becton Dickinson | 309653 | |
| Provette coniche da 50 ml | Corning Falcon | 352070 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Cabina | |||
| CO2 Incubatore | |||
| Sierologico pipette | |||
| 1.000, 200, 20 μ l. pipetta e puntali |
Riferimenti
- Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).
- Lazo, M., et al.
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Ristampe e permessi
