Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.
Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.
कोशिकाओं के विकास के दौरान विशिष्ट संपत्तियों के अधिग्रहण समझ कैसे अंगों की जटिलता और रोग की स्थिति के प्रति अपनी क्षमता विकास की सराहना करने के क्रम में महत्वपूर्ण है। Unrevealing वैश्विक जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल से सेल विनिर्देश और भेदभाव underly कि जीन विनियामक नेटवर्क को समझने के लिए एक बड़ा अनुसंधान धक्का है, पोल द्वितीय बाध्यकारी स्थिति, विनियामक दृश्यों या histones की बाद translational संशोधनों पर प्रतिलेखन कारक अधिभोग।
एक वैश्विक स्तर प्रोटीन पर जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने और आरएनए seq के तरीकों का इस्तेमाल किया जाता है। डीएनए आरएनए-सेक कोडिंग सहित और microRNAs, lncRNAs या snRNAs तरह आरएनए noncoding RNAs के विभिन्न प्रकारों पर सूचित करने के लिए बेहतर तैयार है, जबकि mRNA बहुतायत पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, इन तकनीकों को सक्रिय रूप-लिखित अंतर नहीं कर सकते, स्थिर राज्य mRNA, mRNA के लिए सक्रिय रूप से-अनुवाद और mRNA गिरावट प्रक्रिया में प्रवेश। स्थिर सेंट मापनेmRNA स्तर खाया proteome रचना 1-3 की एक गरीब अनुमान होने के लिए जाना जाता है। इसके विपरीत में, mRNA के लिए सक्रिय रूप से-अनुवाद की पहचान प्रोटीन के उत्पादन का एक और अधिक सटीक तस्वीर देता है।
हालांकि, transcriptomic के अध्ययन मुख्य रूप से जंगली प्रकार हालत 4-7 करने के लिए या विच्छेदित ऊतक पर लाभ या एक विशिष्ट कारक के समारोह के नुकसान की तुलना व्याख्या करने के लिए जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल मुश्किल बनाकर पूरे जीव स्तर पर नेतृत्व किया गया है। सेल को निशाना बनाने के उपकरण, आत्मीयता शुद्धि और संवेदनशीलता के सुधार में हाल के अग्रिमों अब जीनोम चौड़ा एक जीवित जीव में छोटे सेल आबादी या यहां तक कि एकल कक्षों पर विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं।
ड्रोसोफिला में, ट्रांसजेनिक लाइनों के बड़े संग्रह सेल समारोह के लिए आवश्यक आणविक तंत्र का अधिक सटीक मात्रा का ठहराव उपज Gal4 / यूएएस सिस्टम 8-10 के माध्यम से विभिन्न ऊतकों और सेल उप-जनसंख्या के विशिष्ट अस्थायी और स्थानिक लक्ष्य-निर्धारण सक्षम।
<p clनव विकसित दृष्टिकोणों के बीच गधा = "jove_content"> विभाजन से प्रोफाइलिंग आरएनए 11 सक्रिय रूप-अनुवाद पर कब्जा करने के एक तरीके के रूप में वर्णित किया गया था polysome। सुक्रोज ढाल centrifugation के आधार पर इस विधि प्रोटीन या गहरी अनुक्रमण के साथ विश्लेषण किया जब polysome अंश और mRNA के निर्धारण के चयन के जीनोम चौड़ा अनुवाद की अनुमति देता है। Polysome अलगाव अनुवाद प्रक्रिया 12 के दौरान राइबोसोम द्वारा संरक्षित शाही सेना के टुकड़े करने के लिए इसी राइबोसोमल पैरों के निशान की पहचान करने के लिए nuclease पाचन के साथ मिलकर किया जा सकता है। Ribosomal footprinting आरएनए अनुवाद और आरएनए अनुक्रम स्तर के संकल्प और राइबोसोम स्थिति की मात्रा का ठहराव की सटीकता, अनुवाद की दर को मापने के लिए यह संभव बनाता है बढ़ जाती है। हालांकि, यह मुख्य कारण राइबोसोम footprinting प्रक्रिया के अंत में प्राप्त की शाही सेना उपज में मजबूत कमी करने के लिए, translatomes की सेल विशिष्ट अलगाव के लिए लागू नहीं किया गया है तिथि करने के लिए। शाही सेना के आकार चयन संभावित झूठी पी उत्पन्न हो सकता है कि यह देखते हुएयह भी एक समान तरीके में शाही सेना की रक्षा की जा सकती है कि विभिन्न RNPs से ositives, आगे की घटनाओं राइबोसोमल footprinting में सुधार लाने और सेल विशिष्ट दृष्टिकोण के लिए यह अनुकूल करने के लिए आवश्यक हैं।इस तरह के तरीकों में से एक, अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (जाल) Heiman एट अल द्वारा 2008 में वर्णित किया गया है कहा जाता है। और चूहों में न्यूरॉन्स की एक सबसेट से translatome को अलग-थलग करने के लिए आवेदन किया। द्वारा एक सेल प्रकार विशिष्ट तरीके से एक राइबोसोमल प्रोटीन मिलान टैगिंग, polysomes चुनिंदा सेल हदबंदी और छंटनी की श्रमसाध्य कदम के बिना शुद्ध किया जा सकता है। इस मामले में, राइबोसोम की सतह पर 60 राइबोसोमल प्रोटीन L10a EGFP 13 के साथ टैग किया गया था। 2008 के बाद से, कई अध्ययनों एक्स 14-19 चूहों से, विभिन्न प्रजातियों में इस विधि का इस्तेमाल किया है 24 thaliana 20,21, zebrafish 22,23 और एराबिडोप्सिस laevis। जाल विधि भी ड्रोसोफिला मॉडल के लिए अनुकूलित और पुरी करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैवित्तीय वर्ष सेल प्रकार विशिष्ट neuronal कोशिकाओं 25 और astrocytes 26 से mRNAs। बहुमुखी बाइनरी Gal4 / यूएएस प्रणाली एक ऊतक विशेष ढंग से GFP टैग RpL10A व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। वयस्क मक्खियों के प्रमुखों अनुक्रम थे (अखिल तंत्रिका ELAV-Gal4 चालक द्वारा लक्षित) neuronal कोशिकाओं और पृथक आरएनए से polysome चयन प्रदर्शन करने के लिए विच्छेदित कर रहे थे। ऊपर विनियमित जीन की बड़ी संख्या ड्रोसोफिला भ्रूण के विकास में (कम से कम 1 कोशिकाओं की%) वर्तमान दृष्टिकोण अच्छा विशिष्टता है कि यह दर्शाता है और दुर्लभ सेल आबादी के लिए अनुकूल करने के लिए हमें उत्साह, तंत्रिका तंत्र में व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है उन लोगों के लिए corresponded ।
आणविक अभिनेताओं और मॉर्फ़ोजेनेटिक आंदोलनों evolutionarily संरक्षित कर रहे हैं के रूप में ड्रोसोफिला मॉडल के भीतर, भ्रूण अवस्था, विकास की प्रक्रिया के अध्ययन के लिए पसंद का एक मॉडल है। इस मॉडल में अब तक आयोजित केवल ऊतक विशेष transcriptomic दृष्टिकोण इसलिए सेल या परमाणु का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया हैrting और केवल मक्खी भ्रूण में ऊतक / सेल विशिष्ट translatome की रूपरेखा के लिए समर्पित तरीकों के लिए एक बनाने की जरूरत, स्थिर राज्य transcriptome 27-31 अध्ययन करने के लिए सक्षम है। यहाँ हम ड्रोसोफिला भ्रूण को समर्पित पहली जाल प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। इस विधि के साथ लगे-अनुवाद में mRNA भ्रूण प्रति 100 के आसपास की मांसपेशियों की कोशिकाओं का एक बहुत ही सीमित सेल की आबादी में सफलतापूर्वक उच्च गुणवत्ता और विशिष्टता के साथ पृथक किया गया। बाइनरी Gal4 / यूएएस प्रणाली किसी भी विषाक्तता के बिना मांसपेशियों के उप-जनसंख्या में GFP टैग RpL10A की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रयोग किया जाता है, कोई स्पष्ट phenotypes या विकासात्मक देरी पहले से दिखाया गया है 25। ड्रोसोफिला भ्रूण मांसलता को जन्म देगा कि hemisegment प्रति 30 मांसपेशियों के अधिकारी लार्वा की। झुकना पहचान जीन के आसपास के क्षेत्र में खोज की एक नियामक क्षेत्र का उपयोग करके, 30 बहु-केन्द्रक की मांसपेशियों में से 6 लक्षित कर रहे हैं। इस परख में, राइबोसोम अनुवाद बढ़ाव का उपयोग कर mRNA पर स्थिर कर रहे हैंcycloheximide अवरोध करनेवाला। साइटोसोलिक अर्क तो GFP एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ आत्मीयता शुद्धि के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। शुद्ध शाही सेना की गुणवत्ता Bioanalyzer का उपयोग कर मान्य किया गया था। मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (आरटी-qPCR) विशिष्टता और mRNA अलगाव की संवेदनशीलता का निर्धारण किया जाता है और हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल अत्यधिक कुशल है कि प्रदर्शन किया गया।
इस पत्र ड्रोसोफिला भ्रूण में दुर्लभ सेल आबादी के अध्ययन के लिए समर्पित एक संशोधित अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल (डब 'जाल-आर सी') का वर्णन है। सूचना माइक्रोएरे या आरएनए-सेक विश्लेषण, भ्रूण सेल और polysome निकासी के लिए, यानी 1) आवश्यक जैविक सामग्री की मात्रा और अनुकूलित प्रक्रिया के लिए उपयुक्त उपज के साथ विशिष्ट शाही सेना के सफल अलगाव के लिए महत्वपूर्ण कदम पर प्रदान की जाती है; 2) मोती / एंटीबॉडी करने वाली lysate इष्टतम immunoprecipitation के लिए अनुपात; उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ ट्रैप-आर सी प्रयोगों को चलाने के लिए इतनी के रूप में 3) धो बफर संरचना सहित पृष्ठभूमि की कमी की अनुमति के कदम।
इस प्रोटोकॉल यह आसानी से किसी भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू कर रही प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा अर्जित करता है। इस तकनीक को सक्रिय रूप-अनुवाद mRNA के स्तर पर अंतर जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण और इस तरह एक कल्पना में प्रोटीन अभिव्यक्ति को समझने के लिए मार्ग प्रशस्त करने के लिए यह संभव बनाता है एक विशिष्ट समय खिड़की पर ific सेल प्रकार। प्रोटीन बहुतायत अनुवाद और गिरावट प्रक्रियाओं की दर पर निर्भर करेगा लेकिन ध्यान दें कि। जाल विधि का एक प्रमुख सीमा एक सटीक मात्रात्मक तरीके से प्रोटीन सामग्री को मापने के लिए या बाद translational संशोधन का पता लगाने के लिए अपनी असमर्थता है। एक सेल प्रकार विशिष्ट ढंग से, ऐसा करने में, mRNA के शरीर के साथ राइबोसोम घनत्व को मापने के द्वारा मात्रा का ठहराव में सुधार और राइबोसोम एक बहुत शक्तिशाली उपकरण footprinting के साथ संयुक्त जाल बनाने के कर सकते हैं। हाल ही में एक पेपर 34 में, इस संयोजन मानव भ्रूण गुर्दे 293 कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया था। लेखकों streptavidin मोतियों का उपयोग कर RpL10A की एक inducible biotinylated प्रपत्र की आत्मीयता शुद्धि के बाद nuclease footprinting भाग गया। इस तरह से यह सीमा उद्देश्य के लिए आवश्यक जैविक सामग्री की राशि से किया जा रहा है, एक विशिष्ट प्रकार की कोशिका को लक्ष्य करते हुए एक पूरे जीव में राइबोसोम footprinting प्रदर्शन करने के लिए संभव है कि सिद्धांत का एक सबूत है।
"> वैश्विक transcriptomic विश्लेषण के साथ समानांतर में जाल प्रयोगों प्रदर्शन के लिए यह संभव नव लिखित और आरएनए अनुवाद actively-। यह विशिष्ट विकास संदर्भों या विशेष सेल आबादी में जगह लेने के संभावित पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र का गहरा जानकारीपूर्ण किया जाएगा के बीच अनुपात को ट्रैक करने के लिए कर देगा उदाहरण के लिए -by microRNAs।अंत में, जाल एक सेल विशिष्ट ढंग से सक्रिय रूप-अनुवाद राइबोसोम के लिए बाध्य आरएनए की पहचान करने के लिए एक अत्यधिक कुशल, विशिष्ट और संवेदनशील तरीका है। इस विधि जीवों और प्रकार के ऊतकों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ वर्णित नए जाल-आर सी प्रोटोकॉल दुर्लभ सेल आबादी (कुल सेल नंबर का 1% से कम) के लिए और पूरे जीनोम स्तर पर बाद के विश्लेषण के लिए पर्याप्त अंतिम सामग्री की मात्रा के लिए अनुकूलित किया गया था।
इस पद्धति का एक संभव सीमा कंप्यूटर अनुप्रयोग के लिए पर्याप्त राशि में टैग राइबोसोम निर्माण करने के लिए एक मजबूत ड्राइवर की आवश्यकता हैलक्षित सेल प्रकार में अंतर्जात untagged लोगों के साथ Ete। हाल के एक अध्ययन में 25 में, लेखकों 10-30% तक untagged राइबोसोम बनाम टैग किया के अनुपात का अनुमान है।
काफी इस संतुलन में सुधार करना चाहिए यूएएस RpL10A-EGFP प्रतिलिपि संख्या बढ़ रही इस समस्या को दूर करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, वर्णित आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए एक यूएएस GAL4 ट्रांस्जीन जोड़ने GAL4 प्रोटीन का उत्पादन बढ़ाना होगा और परोक्ष रूप से RpL10A-EGFP की अभिव्यक्ति वृद्धि हुई है। इस mRNA पर टैग किया राइबोसोम की एक बेहतर अधिभोग एहसान चाहिए।
यह पहले से ही कुशल दृष्टिकोण भी अधिक शक्तिशाली एक और मात्रात्मक पहलू लाने के लिए या खोज और जीन अभिव्यक्ति पर नियंत्रण के लिए जरूरी है कि आणविक तंत्र को खंडित करने के लिए पूरक के तरीकों द्वारा अनुकूल बनाया जा सकता है कि ध्यान दें।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.
HEPES | Sigma | H4034-1006 | |
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850306P | |
Glycogen | thermo scientific | R0561 | |
Purified BSA 100X | Biolabs | B9001 | |
Yeast tRNA | Sigma | R5636 | |
Super RNase In | Ambion | AM2694 | |
Antibody GFP clone N86/38 | UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated | 75-132 | |
Nonidet P40 | Roche | 11754595001 | |
Precellys 24 Lysis homogenisation | Bertin Technology | ||
Nuclease free water | Nalgene | ||
Dynabeads ProteinG | Invitrogen | 10004D | |
Potassium chloride (KCl) | Applied Biosystem | AM96406 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Applied Biosystem | AM95306 | |
Cellulose waddin unbleached | VWR | 115-2597 | |
Sieves 112, 355, 710 um | Retsch | ||
TRiZol | Invitrogen | 15596-018 | |
MagRack 6 | GE HealthCare | 28948964 | |
Low binding filter tips | ClearLine | ||
Rnase free tube 1,5 mL | ClearLine | 390689DD | |
Tween 20 | Fischer Bioreagent | BP337-500 | |
Cycloheximide | Sigma | C1985 | |
Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free | Roche | 11836170001 |