Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
Het gebied van regeneratieve geneeskunde en tissue engineering gaat snel, met doorbraken in tracheale en nieren regeneratie twee opmerkelijke recente prestaties. De biomaterialen ontwikkeld in tissue engineering worden steeds toegankelijker, met mogelijkheden om dergelijke protocollen over te dragen aan minder gespecialiseerde laboratoria. Een veld gevuld te profiteren door middel van een toenemend gebruik van biomaterialen in vitro diagnostiek.
In vitro studies zijn een belangrijk platform voor intra-cellulaire signaalwegen binnen enkele cel-types te onderzoeken, en hebben geholpen af te bakenen mechanismen die ten grondslag liggen tal van ziekten pathophysiologies. Deze studies algemeen gebruik gemaakt van een enkele celsoort die wordt gekweekt als een monolaag op weefselkweekkunststof (TCP); een tweedimensionale (2D) stijf oppervlak veel minder elastisch en poreus dan de driedimensionale (3D) omgeving cellen worden blootgesteld aan binnen een weefsel of orgaan. Dierlijke modellen zijn van oudsher employed effecten in vitro ook vertalen naar gehele weefsel te bevestigen en kan ook worden gebruikt als pre-klinische platforms om menselijke ziekten te onderzoeken. Echter, inter-species verschillen ondermijnen deze afhankelijkheid diermodellen in ons begrip van menselijke ziekten -. Zo is veel kennis van de longziekte astma basis van een muismodel ondanks inherente verschillen tussen de menselijke conditie en dit model met weinig bewijs van mestcel infiltratie van de gladde spieren bundel luchtwegen of het vermogen tot spontane ziekteontwikkeling in het dier modelleren 3,4. Er zijn ook ethische overwegingen met betrekking tot het gebruik van dierlijke modellen, met de "3 V's" standaard "vervanging, verfijning en vermindering" in dierproeven worden aangemoedigd in het Verenigd Koninkrijk en andere landen.
Een aantrekkelijk alternatief zou de reprise van menselijk weefsel in vitro creëren structuurs aan het coöperatieve karakter tussen volwassen menselijke celtypes in één apparaat te onderzoeken. Cellen bestaan in 3D multi-cellulaire structuren binnen weefsel, elk binnen een unieke micro-omgeving. Het kweken van cellen op TCP laat alleen de cultuur van celmonolagen, niet kunnen repliceren deze omgeving, of moet de capaciteit voor multi-celcultuur. Biomaterialen vooruitgang biedt de mogelijkheid om zowel natuurlijke en synthetische 3D-platforms voor celcultuur ontwikkelen. Cellen ontdane ECM kan worden gebruikt voor 3D-celkweek bij recellularized met andere celtypen waaronder stamcellen 1, maar dergelijke protocollen kan ingewikkeld en tijdrovend zijn, door de beschikbaarheid van weefsel beperkt en grotendeels van niet-humane oorsprong. Andere protocollen maken een grotere controle over de cellulaire omgevingen gecreëerd zoals nanoimprinting, ECM afzetting, cellaag technologieën of electrospinning. Electrospinning creëert geweven 3D poreuze matten van vezels met een diameter van nanometer tot micrometer, replicating natuurlijke ECM dimensies. Electrospun steigers worden steeds vaker gebruikt als 3D-cel kweken platforms -. Manipulatie van de electrospinning parameters worden ingewikkelde controle scaffold eigenschappen zoals poriëngrootte, vezeldiameter, topografie en uitlijning en oppervlaktechemie. Veranderingen van deze parameters bleken direct beïnvloeden celadhesie en de groei, wanneer cellen werden gekweekt in isolement.
Deze voordelen zijn in het huidige onderzoek werd benut om het kweken van meerdere celtypen maken als een enkele 3D-weefsel constructie, met behulp van de luchtwegen bronchiole als model 3D-weefselstructuur. De bronchiole wand bestaat uit drie gebieden (figuur 1). Het slijmvlies is waar epitheelcellen zitten aan de lucht-vloeistof interface (ALI), die een belangrijke belemmering voor de externe omgeving. Ze bevinden zich op de reticulaire basaal membraan (RBM), een strak compacte ECM bestaat voornamelijk uit collagen IV, perlecans en laminins. De sub-mucosale laag direct onder het slijmvlies, een poreuze regio bestaat uit meerdere soorten cellen, waaronder fibroblasten, myofibroblasten en infiltreren leukocyten onder aandoeningen gevonden. Tenslotte gladde spier bundels wikkel rond de luchtweg in een spiraalvormige wijze, en bestaan uitgelijnde vellen van gladde spieren van de luchtwegen (ASM). Het is relatief contractiel toestand van de gladde spieren dat luchtwegen toonregeling. De tewerkstelling van elektrogesponnen steigers binnen de longen had tot voor kort beperkt tot regeneratieve doeleinden; met een electrospun tracheale vervanging met succes getransplanteerd. Hoewel succesvol, zulke behandelingen zijn beperkt in aantal en zijn gericht op de trachea, gezien de relatief eenvoudige aard van de functie van het weefsel. Beperkte voorbeelden van de luchtwegen modellen die gebruikt worden voor in vitro diagnostiek bestaan, en zijn vooral gericht op gladde spiersamentrekking metingen. De niet-toxisch en geenn-afbreekbaar polymeer polyethyleentereftalaat (PET) is eerder electrospun en werd gebruikt in de onderhavige studie scaffolds geproduceerd kan worden opgeslagen gedurende langere tijd te waarborgen zonder afbreuk (waardoor ze worden "off the shelf"), en ook geschikt voor stabiele celcultuur over langere perioden. Eerdere studies van onze groep hebben aangetoond dat het gebruik van drie varianten van een basische electrospinning protocol, drie afzonderlijke PET electrospun scaffolds kan worden geproduceerd om een optimale topografieën van kweken luchtweg epitheelcellen, fibroblasten en gladde spiercellen geïsoleerd 21,22 en de co-cultuur van de luchtweg voorzien epitheel- en fibroblastcellen 22. Vezeldiameter bleek grote invloed epitheliale functionaliteit 22 en fiber uitlijning liet toe uitgelijnde vellen van gladde spieren 21. Deze studies werden onafhankelijk van elkaar onder statische omstandigheden uitgevoerd. In de huidige studie, deze different scaffolds gemaakt met volledig gedifferentieerde volwassen humane cellen werden tezamen gekweekt gedurende een week in ALI in een commercieel verkrijgbaar bioreactor als 3D deel van de luchtwegwand, die een fysiologisch relevante in vitro model van de luchtwegen inter-cellulaire responsen te onderzoeken. Hoewel dit protocol gebruikt de luchtweg bronchiole als modelsysteem zou kunnen worden aangepast als een platform voor de 3D co-cultuur van mucosale eenheden uit andere organen.
Het vermogen om polymere vezels structurele eigenschappen die vergelijkbaar zijn met natuurlijke ECM electrospin heeft geleid tot talrijke natuurlijke of synthetische polymeren of polymeermengsels die electrospun soort ruimten herscheppen. Manipulatie van de procesparameters (inclusief polymeer keuze, polymeer concentratie, oplosmiddel naaldtip afstand en temperatuur) kunnen allemaal invloed schavot kenmerken; maar sommige parameters kunnen grotere impact op steiger eigenschappen dan de andere 25 hebben. Bij het aanpassen van PET vezeldiameter, vonden we de sleutelparameters voor de concentratie van het toegepaste polymeer, de snelheid waarmee de polymeeroplossing was elektrogesponnen, en de diameter van de naald zijn. Wanneer elektrospinnen uitgelijnd vezels de sleutelparameters de collectie methode (een draaiende as), en de snelheid van de spil roteert. Door het verminderen van de doorn snelheid tot 60 rpm, vonden we de willekeurig uitgelijnd steigers geproduceerd toonde grotere steiger uniconformiteit ten opzichte van electrospinning op een vlakke collector plaat.
De kenmerken van gedecellulariseerde luchtwegen weefsel werden geanalyseerd om aanwijzingen te geven voor de diverse steiger topografieën ontwikkeld voor de cultuur van elke luchtweg celtype. Electrospun nanovezels een aantrekkelijke scaffold basaalmembraan structuren vanwege de kleine poriegrootte, maar hoge totale poreusheid die zorgt voor een grotere vraag metaboliet terwijl beperking cellulair verkeer repliceren. 9 Terwijl optimale electrospinning parameters, diverse PET concentraties en stroomsnelheden werden getest. De dunste vezels werden bereikt onder toepassing van een 6% gew / vol PET -oplossing, andere groepen gebruikt. Echter, een hoge mate van kralen, en een gebrek aan uniformiteit waren voortdurende problemen. Aanvankelijke pogingen om de kralen te verwijderen inclusief het toevoegen van een kationisch oppervlakte, cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB), aan de oplossing van de oppervlaktespanning verlagen en testen van diverse bronnenPET. De toevoeging van surfactant verminderde de hoeveelheid beading, maar niet volledig. Na het uitproberen van een aantal commerciële bronnen van PET pellets, werd food grade drank fles PET gebruikt, door snijden drankflessen en het oplossen van deze in de DCM: TFA oplosmiddel oplossing. Met dit als de PET bron resulteerde in een toename vezel uniformiteit en vermindering van vezel beading. Door verhogen van de concentratie van de oplossing lichtjes tot 8% w / v en het reduceren van de diameter naald (18G tot 23G) we consequent geproduceerd foutvrij nanovezels met een vezeldiameter van ongeveer 250 nm. Electrospun nanovezels scaffolds kan zeer elektrostatische bij het afhalen van de doorn making hanteren van de steigers moeilijk. Dit werd verbeterd door het opslaan van de steigers aluminiumfolie na het spinnen en het weken in 70% IMS voor gebruik. Dit leek te helpen verdrijven van de resterende elektrostatische lading links op de steiger van de elektrospinproces.
Om boven te biedenographies vergelijkbaar met de individuele micro-omgevingen waarmee de drie belangrijkste luchtwegen celtypen binnen de luchtwegen muur, een basis electrospinning protocol werd aangepast aan drie unieke steigers voor deze celtypen te produceren: door elektrospinnen een lage concentratie PET-oplossing langzaam, werden willekeurig afgestemd nanovezels gegenereerd, waarop epitheliale cellen werden geënt (het nabootsen van de RBM). Door elektrospinnen een hogere concentratie PET oplossing sneller, werden willekeurig uitgelijnd microvezels verkregen (een min poreus scaffold), waarin fibroblasten werden gezaaid (nabootsen van de sub-mucosale gebied direct onder de REM). Door elektrospinnen lage concentratie PET oplossing op een hoge snelheid roterende mandrel uitgelijnd nanovezels geproduceerd, waarop gladde spiercellen georiënteerd in de vezelrichting, produceren uitgelijnde vellen van cellen.
Verhoogde vezeldiameters leiden tot een verhoogde poriën, waardoor een grotere cel penetration in de steigers en zo bijdragen aan het creëren van een echte 3D-omgeving. Microfiber scaffolds werden gebruikt voor het kweken van fibroblasten in het onderzoek dat de cellen verbleven op meerdere vlakken binnen de scaffold. Door verhogen van de PET concentratie 30% gew / vol, werden PET vezels met een gemiddelde diameter van 2,5 urn vervaardigd. Vezels grotere diameter (≈ 4 pm) werden vervaardigd onder toepassing van een 35% gew / vol oplossing PET, maar scaffold dikte uniformiteit was verloren en hogere variabiliteit tussen individuele vezels duidelijk. Poriën in de microfiber steiger waren meer dan 7 keer groter dan die gemeten in de nanovezel steigers (10.45 pm vs respectievelijk 1,43 pm), maar nog steeds statische zaaien van cellen voorzien beperkte cellulaire penetratie. Dit werd verbeterd door het dynamisch zaaien de cellen met behulp van een orbitale menger, een eerder aangetoond effectief methode.
Zeer gericht nanovezel steigers zijn gemaakt door elektrospinnen een 10%wt / vol PET oplossing op de doorn roteert met 2000 rpm (≈ 440 m · min -1). De PET-concentratie werd verhoogd van 8% tot een onregelmatige golfachtige morfologie die vezels vertoonden bij lagere concentraties te voorkomen. Ondanks de toegenomen concentratie uitlijnen van de vezels verminderde de gemiddelde vezeldikte (216 nm versus 255 nm, uitgelijnd ten opzichte random). De hoge snelheid van de doorn trekken van de vezels voordat zij gedroogd waarschijnlijk dit effect veroorzaken. De uitlijning van de vezels beïnvloed de afstemming van gladde spiercellen en heeft ook andere fysiologische effecten op de gladde spiercellen die elders 21 zijn gekarakteriseerd.
De belangrijkste beperking van dit protocol is het onvermogen om het levende cellen op / in de steigers maken initiële cel-gehechtheid of differentiatie over een langere periode niet mogelijk om vast te stellen zonder in te boeten monsters. Dit betekent dat de meeste optimalisatie optreedt na de kweekperiode, dat wil zeggen, op te lossening samples en vervolgens meten of celkweek succesvol was na niet tijdens de celcultuur. Observeren van een kleurverandering in steigers geïncubeerd in AlamarBlue (blauw naar roze) geeft cellen aanwezig en levensvatbaar zijn, maar is niet ideaal. Elektrospinning transparanter polymeren zoals gelatine kunnen helpen bij het visualiseren van cellen op de steigers. The electrospinning van nanofibrous scaffold in ons model kon de replicatie van de luchtweg RBM, eveneens bestaande uit dichte nanovezels waarop de epitheliale cellen bevinden. Eerder is aangetoond dat structurele cellen niet kunnen migreren door de nanovezel stellage 22, alhoewel immune cellen kunnen (gegevens niet getoond). Hoewel voordelig voor het kweken van specifieke celtypen op een 3D-oppervlak (bijvoorbeeld epitheliale en endotheliale cellen), deze voorkomen van structurele celmigratie door nanovezels kunnen schadelijk voor het kweken van andere celtypen. Omdat gladde spieren kan niet migreren door the uitgelijnd nanovezel steiger we samengesteld de tri-gelaagde coculture met de gladde spieren en fibroblast lagen tegenover elkaar (in tegenstelling tot de uitgelijnde steiger tussen de twee soorten cellen). Hoewel dit stelt de cellen in dichte appositie, kan de huidige studie niet vaststellen of een celtype (ofwel de fibroblasten of gladde spier) de hele laag zou halen gedurende een verlengde kweekperiode. Ondanks deze beperkingen is een levensvatbare drielaags model van de luchtwegwand ontwikkeld die een alternatief platform verschaft om de interacties tussen de verschillende celtypen te onderzoeken. Eenzelfde tri-layered onderzoek is onlangs gepubliceerd waarin fibroblasten ingebed in een cilindrisch collageen I hydrogel gladde spieren gezaaid op het buitenoppervlak en epitheelcellen binnen het luminale oppervlak 17. De mechanische stabiliteit van de electrospun scaffolds hier ontwikkeld zou vergelijkbaar buisvormige constructen mogelijk te vormen, en blijft een stroom research doel binnen onze groep. Hoewel het onderzoek zich gericht op de luchtwegen, verschillende organen in het lichaam deel deze fundamentele mucosale structuureenheid, en door modificeren van de huurders die in deze studie kan laadborden worden ontwikkeld weefsel dat een basaalmembraan eenheid met bloedvaten, de blaas en de cornea, waarbij collageen gebaseerde multi-layered modellen zijn gebruikt.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |