Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
Feltet av regenerativ medisin og tissue engineering er raskt fremme, med gjennombrudd i luftrør og nyre regenerering to bemerkelsesverdige siste prestasjoner. De biomaterialer utviklet i tissue engineering blir mer tilgjengelig, med muligheter til å overføre slike protokoller til mindre spesialiserte laboratorier. Ett felt primet å dra gjennom økende bruk av biomaterialer er in vitro diagnostikk.
In vitro-studier er en viktig plattform for å undersøke intracellulære signalveier innenfor encellete-typer, og har hjulpet avgrense mekanismene bak en rekke sykdoms pathophysiologies. Disse studiene generelt stole på en enkelt celletype som dyrkes som et monolag på vevskultur plast (TCP); en to-dimensjonal (2D) Hard overflate langt mindre elastisk og porøst enn de tre-dimensjonale (3D) miljø cellene blir utsatt for i løpet av et vev eller organ. Dyremodeller har tradisjonelt vært employed å bekrefte effektene vist in vitro også settes til hele vev, og kan også anvendes som pre-kliniske plattformer for å undersøke menneskelige sykdommer. Men forskjellene inter-arter undergrave denne avhengigheten av dyremodeller i vår forståelse av sykdom hos mennesker -. For eksempel er mye forståelse av lungesykdom astma basert på en musemodell på tross iboende forskjeller mellom den menneskelige tilstand, og denne modellen inkludert lite bevis for mastcelleinfiltrasjon av luftveisglattmuskelbunt, eller kapasiteten for spontan sykdomsutvikling inne i dyret modellere 3,4. Det er også etiske betraktninger om bruk av dyremodeller, med "3R" standard of "erstatning, avgrensning, og reduksjon" i dyreforsøk blir oppmuntret i Storbritannia og andre land.
Et attraktivt alternativ ville være reprisen av menneskelig vev in vitro skape strukturs å undersøke samarbeidende natur mellom voksne humane celletyper i en enkelt enhet. Celler eksistere i 3D flercellede strukturer i vev, hver innenfor et unikt mikromiljø. Dyrking av celler på TCP bare tillater kulturen av cellemonolagene, ute av stand til å replikere dette miljøet, eller gi kapasitet for multi-cellekultur. Biomaterialer avansement gir mulighet til å utvikle både naturlige og syntetiske 3D plattformer for cellekultur. Decellularized ECM kan benyttes for 3D cellekultur ved recellularized med andre celletyper, inkludert stamceller 1, men slike protokoller kan være komplisert og tidkrevende, med tilgjengeligheten av vev og i stor grad begrenset av ikke-human opprinnelse. Andre protokoller tillate større kontroll over mobil miljøer opprettet som nanoimprinting, ECM deponering, celle ark teknologier, eller electro. Electro skaper ikke-vevet 3D porøse matter av fiber med diameter fra nanometer til mikrometer, replicating naturlige ECM dimensjoner. Elektrospunnede stillaser blir i økende grad brukt som 3D celledyrknings plattformer -. Manipulering av elektrospinning parametrene muliggjør innviklet kontroll over stillas egenskaper som porestørrelse, fiberdiameter, topografi og innretting, og overflatekjemi. Endringer av slike parametre har blitt vist å direkte påvirke celle adhesjon og vekst, når cellene ble dyrket i isolasjon.
Disse fordelene har blitt utnyttet i den foreliggende studie for å tillate dyrkning av flere celletyper som et enkelt vev 3D-konstruksjon, ved hjelp av luftveiene bronchiole som modell 3D-vevet struktur. Den bronchiole vegg består av tre hovedregioner (Figur 1). Slimhinnene er der luftveis epitelceller sitte på luft-væske-grensesnittet (ALI), noe som gir en viktig barriere mot ytre miljø. De befinner seg på den retikulære basalmembran (RBM), et tett kompakt ECM består hovedsakelig av collagno IV, perlecans og laminins. Den sub-slimhinne lag er funnet direkte under mucosa, et mer porøst område består av flere celletyper, inkludert fibroblaster, myofibroblasts og infiltrerende leukocytter i henhold til sykdomstilstander. Endelig glatt muskelbunter vikle rundt luftveiene i en spiralformet måte, og består av innrettede ark av glatt muskulatur i luftveiene (ASM). Det er glatt muskulatur relative kontraktile tilstand som styrer luftveis tone. Ansettelse av elektrospunnede stillas innenfor lungesystemet hadde inntil nylig vært begrenset til regenerative formål; med en elektrospunnede tracheal erstatning blir vellykket transplantert. Mens vellykket, slik behandling ikke er begrenset i antall, og er fokusert på luftrøret på grunn av den relative enkle natur vevets funksjon. Begrensede eksempler på luftveis modeller som benyttes for in vitro diagnostikk eksisterer, og er i hovedsak fokusert på glattmuskelkontraksjon målinger,. De ikke-toksiske og ikke noen-nedbrytbar polymer polyetylentereftalat (PET) er tidligere blitt elektrospunnede, og ble anvendt i denne undersøkelsen for å sikre stillaser som produseres kan bli lagret i lange perioder uten å forringe (som tillater dem å bli brukt "hyllevare"), og også være passende for stabile cellekultur over lengre tidsperioder. Tidligere studier fra vår gruppe har vist at bruk av tre varianter av en grunnleggende electro protokollen, kan tre individuelle PET elektrospunnede stillaser produseres for å gi optimal topografi for dyrking luftveiene epitel, fibroblast, og glatte muskelceller i isolasjon 21,22 og coculture av luftveiene epiteliale og fibroblast celler 22. Fiber-diameter ble funnet å sterkt påvirke epitelial funksjonalitet 22, og fiberinnrettings tillot dannelse av innrettede ark av glatt muskulatur 21. Disse studier ble gjort seg uavhengig av hverandre under statiske betingelser. I denne studien, disse different stillasene, som inneholder fullt differensiert voksen menneskeceller har blitt cocultured for en uke på ALI i et kommersielt tilgjengelig bioreaktor som et 3D-delen av luftveiene veggen, og gir en fysiologisk relevant in vitro modell for å undersøke luftveis inter-cellulære responser. Mens denne protokollen er ved hjelp av luftveiene bronchiole som et modellsystem, kan det være innrettet som en plattform for 3D coculture av slimhinne enheter fra andre organer.
Evnen til å electrospin polymere fibre med strukturelle egenskaper er sammenlignbare med naturlige ECM har ført til en rekke naturlige eller syntetiske polymerer eller polymerblandinger blir elektrospunnede å gjenskape disse miljøene. Manipulasjon av prosessparametre (inkludert polymer valg, polymerkonsentrasjon, løsemiddel, nålespissen avstand og temperatur) kan alle påvirke stillas kjennetegn; men noen parametere kan ha større innvirkning på stillas egenskaper enn andre 25,. Når modifiser PET fiberdiameter, har vi funnet nøkkelparametere for å være den konsentrasjon av polymer som anvendes, hastigheten ved hvilken polymerløsning ble elektrospunnede, og nålens diameter. Når electro orienterte fibre nøkkelparametrene er oppsamlingsmetoden (en roterende spindel), og hastigheten ved hvilken foringen roterer. Gjennom å redusere stammen hastighet til 60 rpm, vi fant tilfeldig justert stillasene produsert viste større stillas unimelse i forhold til electro på en flat samler plate.
Karakteristikken av decellularized luftveisvev ble analysert for å gi veiledning for de ulike stillas topographies utviklet for kulturen i hver luftveis celle-type. Elektrospunnede nanofibers er en attraktiv stillaset til å replikere basalmembranstrukturer på grunn av den lille porestørrelsen, men høy total porøsitet som gjør det mulig for økt metabolitt diffusjon samtidig begrenser cellulær bevegelse. 9. Mens optimalisere elektrospinnings parametere, ble en serie av PET-konsentrasjoner og strømningshastigheter testes. De tynneste fibrene ble oppnådd ved hjelp av en 6% vekt / volum PET-løsningen, som tidligere ble brukt av andre grupper. Imidlertid høye nivåer av perler, og en mangel på ensartethet var stadige problemer. Innledende forsøk på å fjerne perler inkludert tilsetning av et kationisk overflateaktivt middel, cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB), til løsningen for å senke overflatespenningen, og testing av forskjellige kilderPET. Tilsetningen av overflateaktivt middel reduseres mengden av perler, men ikke helt. Etter å ha prøvd en rekke kommersielle kilder til PET pellets, ble mat grade drikke flaske PET brukes, ved å kutte opp drikkeflasker og oppløse disse i DCM: TFA løsningsmiddel. Med dette som PET kilde resulterte i en økning i fiber ensartethet og en reduksjon i fiber beading. Ved å øke konsentrasjonen løsningen litt til 8% vekt / vol, og å redusere diameteren nål (18G til 23G) var konsekvent produsert defekt frie nanofibers med en fiberdiameter på tilnærmet 250 nm. Elektrospunnede nanofiber stillasene kan være svært elektro ved henting fra stammen gjør manuell håndtering av stillasene vanskelige. Dette ble forbedret ved å lagre stillasene i aluminiumsfolie etter spinning og suger i 70% IMS før bruk. Dette så ut til å hjelpe spre restelektrostatisk ladning igjen på stillaset fra electro prosessen.
Å yte toppographies ligner de enkelte mikromiljøer som oppdages av de tre hovedluftcelletyper innenfor luftveisveggen, ble en grunnleggende elektrospinning protokoll tilpasset for å frembringe tre unike stillas for disse celletyper: ved hjelp av elektro en lav konsentrasjon PET-løsningen langsomt ble tilfeldig innrettede nanofibers genereres hvorpå epiteliale celler ble sådd (ligne RBM). Ved hjelp av elektro en høyere konsentrasjon PET-løsningen i et raskere tempo, ble tilfeldig innrettede genererte mikrofibre (fremstilling av en mer porøs stillas), inn i hvilken fibroblaster ble sådd ut (ligne sub-slimhinne område umiddelbart under RBM). Ved hjelp av elektro en lav konsentrasjon PET-løsningen på en med stor hastighet roterende spindel innrettet nanofibers ble produsert, på hvilket det glatte muskelceller som er orientert i fiberretningen, produserer innrettet ark av celler.
Økte fiberdiametere føre til økt porestørrelsen, slik at større celle penetration inn i stillaser og så bidra til å skape en ekte 3D-miljø,. Mikrofiber stillaser ble anvendt for kulturen av fibroblaster i undersøkelsen for å sikre at cellene oppholdt seg på flere plan i stillaset. Ved å øke PET-konsentrasjonen til 30% vekt / volum, ble PET-fibre med en gjennomsnittlig diameter på 2,5 um produsert. Større diameter fibre (≈ 4 um) ble fremstilt ved anvendelse av en 35% vekt / vol PET-løsningen, men stillaset tykkelse ensartethet var tapt og større variasjon mellom individuelle fibrene var tydelig. Porene i mikrofiber stillaset var over 7 ganger større enn de som ble målt i nanofiber stillasene (10,45 um vs henholdsvis 1,43 um), men fremdeles statisk såing av cellene tilgjengelig begrenset cellulær penetrasjon. Dette ble forbedret ved dynamisk utsåing av cellene ved hjelp av en orbital mixer, en metode vist seg å være effektiv som tidligere.
Meget justert nanofiber stillaser ble skapt av electro en 10%vekt / vol PET-løsningen på doren roterer ved 2000 rpm (≈ 440 m x min-1). PET-konsentrasjonen ble øket fra 8% for å hindre en uregelmessig bølgelignende morfologi som fibre oppviste ved lavere konsentrasjoner. Til tross for økningen i konsentrasjonen, samkjøre fibrene reduseres den gjennomsnittlige fiber diameter (216 nm vs 255 nm, justert vs. tilfeldig). Den høye hastighet av doren å trekke fibrene ut før de er tørket er egnet til å forårsake denne effekten. Innrettingen av fibrene påvirkes justeringen av ASM celler, og har også andre fysiologiske virkninger på ASM celler som er blitt karakterisert steder 21.
Den store begrensning av denne protokollen er manglende evne til bilde levende celler på / i stillasene gjør første celle-vedlegg eller differensiering over en lengre tidsperiode umulig å fastslå uten å ofre prøver. Dette betyr at de fleste optimalisering skjer etter kultur perioden, dvs. fastsetteing prøver, og deretter måling av hvorvidt cellekulturen var vellykket etter ikke under cellekultur. Observere en fargeendring i stillaser ruges i alamarBlue (blå til rosa) viser celler er til stede og levedyktig, men er ikke ideelt. Electro mer transparente polymerer som gelatin kan hjelpe til med å visualisere celler på stillasene. Den elektrospinning av en nanofibrous stillas i vår modell tillates replikasjon av luftveiene RBM, likeledes består av tett nanofibers som epitelceller bor. Det har tidligere vært vist at strukturelle celler ikke kan migrere gjennom nanofiber stillaset 22, selv om immunceller er i stand til å (data ikke vist). Selv om fordelaktige for dyrking av spesifikke celletyper på en 3D-overflate (for eksempel epithelial og endotelceller), kan dette forhindre strukturell celle migrasjon gjennom nanofibers være skadelig for dyrking av andre celletyper. Som glatt muskulatur er i stand til å migrere gjennom the innrettet nanofiber stillaset vi samlet tri-lagdelte coculture med den glatte muskel og fibroblast lagene vendt mot hverandre (i motsetning til den innrettede stillaset som skiller de to celletyper). Mens dette gjør at cellene skal være i nær apposisjon, kan denne studien ikke fastslå hvorvidt en celletype (enten fibroblast eller glatt muskulatur) vil innhente hele lag over et mer langvarig dyrkningsperiode. Til tross for disse begrensninger, har en levedyktig tri-lags modell av luftveisveggen blitt utviklet som gir en alternativ plattform for å undersøke interaksjonen mellom disse flere celle-typer. En tilsvarende tri-lag studie har nylig blitt publisert hvor fibroblaster ble innleiret i en sylindrisk kollagen I hydrogel med glatt muskel podet på den ytre overflaten og epitelceller i den luminale overflaten 17. Den mekaniske stabilitet av elektrospunnede stillasene utviklede her vil tillate lignende rørformede konstruksjoner som skal dannes, og er fortsatt en strøm reseaRCH mål i gruppa vår. Mens undersøkelsen har fokusert på luftveiene, flere organer i kroppen dele denne grunnleggende mucosal strukturell enhet, og gjennom å endre beboerne fremhevet i denne studien, kan tilsvarende plattformer bli utviklet for vev inneholdende en basalmembran-enhet inkludert blodårer, blære og hornhinnen, hvor kollagen basert lagdelte modeller har blitt ansatt.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |