Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
rejeneratif tıp ve doku mühendisliği alanında hızla trakea ve böbrek rejenerasyon iki önemli yeni başarıları ile devrimler, ilerliyor. doku mühendisliği geliştirilen biyomalzemeler az özelleşmiş laboratuvarlarda tür protokolleri aktarmak için fırsatları ile daha erişilebilir hale gelmektedir. Biyomalzeme kullanımını artırarak faydalanmak için astarlanmalıdır bir alan vitro diagnostik bulunmaktadır.
In vitro çalışmalar tek hücre tipleri içinde hücre içi sinyal yolları araştırmak için önemli bir platform olduğunu ve çok sayıda hastalık patofizyolojilere yatan mekanizmaları tasvir yardımcı olmuştur. Bu çalışmalar genellikle doku kültürü plastik (TCP) bir tek tabaka olarak kültürlü olmanın bir tek hücre tipi güveniyor; daha az esnek ve gözenekli bir üç boyutlu (3D) bir ortam hücrelerden daha iki boyutlu (2D), sert yüzey, bir doku ya da organın içinde maruz kalmaktadır. Hayvan modelleri, geleneksel E olmuşturaynı zamanda bütün dokuya tercüme in vitro tespit etkilerini teyit etmek için mployed, ve aynı zamanda insan hastalıklarının araştırılması, klinik öncesi platformlar olarak kullanılabilir. Ancak, türler arası farklılıkların insan hastalığı anlayışımızda hayvan modellerinde bu güveni zayıflatmak -. Örneğin, akciğer hastalığı, astım çok anlayış küçük hava yolu düz kas demetinin mast hücresi infiltrasyonu kanıtı, ya da hayvan içinde kendiliğinden hastalık gelişimi için kapasite dahil olmak üzere insan durumuna ve bu model arasındaki içsel farklılıklara rağmen bir fare modelinde dayanır 3,4 modeli. İngiltere ve diğer ülkelerde teşvik ediliyor hayvan deney "yerine, arıtma ve azaltma" nin "3R" standardı ile hayvan modellerinde kullanımı ile ilgili etik hususlar da vardır.
Çekici bir alternatif yaratma in vitro yapısında insan dokusunun tekrarlama olacağınıs, tek bir ünitede yetişkin insan hücre türleri arasındaki işbirliği doğasını araştırmak için. Hücreler benzersiz bir mikro-çevre içinde her doku içinde 3D çoklu-hücresel yapılar var. TCP hücrelerin kültürlenmesi sadece bu ortamı çoğaltmak ya da çok hücreli kültür kapasitesi sağlayamaz hücre mono tabakaları, kültür sağlar. Biyomalzeme ilerleme hücre kültürü için doğal ve sentetik 3D platformları hem geliştirme fırsatı sunmaktadır. Kök hücre 1 de dahil olmak üzere başka hücre tipleri ile recellularized olduğunda hücresizleştirilmiş ECM doku sınırlı ve büyük ölçüde insan olmayan kökenli durumu ile, bununla birlikte bu protokoller, karmaşık ve zaman alıcı olabilir, 3D hücre kültürü için de kullanılabilir. Diğer protokoller nanoimprinting, ECM birikimi, hücre tabaka teknolojileri, ya da elektrospinning gibi oluşturulan hücresel ortamlar üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Elektrospinning nanometreden mikrometre arasında değişen çap, r elyafların dokunmamış 3D gözenekli tabakalar oluştururDoğal ECM boyutlarını eplicating. Electrospun iskeleleri giderek 3D hücre kültürü platformları olarak istihdam edilmektedir -. Elektrospinning parametreleri manipülasyonu gibi gözenek boyutu, elyaf çapı, topografya ve uyum ve yüzey kimyası olarak iskele özellikleri üzerinde karmaşık kontrol sağlar. Hücreler izole kültive edildiğinde, bu parametrelerin değişiklikler, doğrudan hücre yapışmasını ve büyümeyi etkilediği gösterilmiştir.
Bu avantajlar bir modeli 3D doku yapısı olarak hava yolu bronşiole kullanarak, tek bir 3D doku yapı olarak birden fazla hücre tiplerinin kültürlenmesini izin Bu çalışmada istismar edilmiştir. Bronşiyol duvarı, üç ana bölge (Şekil 1) oluşur. havayolu epitel hücreleri dış ortama önemli bir bariyer sağlayarak, hava-sıvı arayüzü (ALI) oturup nerede mukoza olduğunu. Onlar retiküler bazal membran (RBM) bulunması, sıkıca kompakt ECM esas collag oluşanen IV perlecans ve Lamininler. alt mukoza tabakası doğrudan mukoza, fibroblastlar, miyofibroblastlar de dahil olmak üzere hastalık koşullarında lökosit infiltre birden fazla hücre tiplerinden müteşekkildir, daha gözenekli bir bölümünün altında bulunur. Sonunda düz kas demetleri bir sarmal biçimde havayolu etrafında sarın ve hava yolu düz kasında (ASM) hizalanmış yaprak oluşmaktadır. Bu havayolu tonunu kontrol pürüzsüz kasının kasılma göreceli durumudur. Pulmoner sistem içinde electrospun iskelelerinin istihdam yakın zamana kadar rejeneratif amaçlı sınırlı olmuştu; bir electrospun trakeal yerine başarılı bir şekilde nakledilen edilir. Başarılı iken, bu tür tedaviler sayıda sınırlıdır ve bağlı dokusunun fonksiyonu göreceli basit doğasına trakea üzerine odaklanmıştır. In vitro teşhis için kullanılan havayolu modellerinin sınırlı örnekleri vardır, ve çoğunlukla düz kas kasılması ölçümlerine odaklanmıştır. toksik-olmayan ve hiçbirn-bozunur polimer polietilen tereftalat (PET) daha önce electrospun edilmiş ve uygun zamanda (onlara "kapalı raf" kullanılmasına izin) bozmadan uzun süre saklanabilir olabilir üretilen iskeleleri sağlamak için bu çalışmada kullanılan ve edildi uzun süreler boyunca kararlı hücre kültürü için. Grubumuzun Önceki çalışmalar temel elektrospinning protokolünün üç varyasyon istihdam üç ayrı PET electrospun iskeleleri kültür havayolu epitel, fibroblast için optimal topografyalarının ve izolasyon 21,22 düz kas hücreleri ve solunum yolu kokültürü sağlamak için üretilebilir göstermiştir epitel ve fibroblast hücreleri 22. Elyaf çapı büyük ölçüde epitel işlevselliği 22 etkilediği bulundu ve fiber hizalama düz kas 21 hizalanmış yaprak nesil izin verildi. Bu çalışmalar, statik koşullar altında, birbirinden bağımsız olarak yapıldı. Bu çalışmada, bu differetam olarak farklılaşmış yetişkin insan hücreleri içeren nt iskelesi, hava yolu arası hücresel yanıtları araştırmak için bir in vitro model fizyolojik ilgili sağlayan hava yolu duvarının 3B bölümü olarak bir ticari olarak temin edilebilir bir biyo-reaktörde ALI az bir hafta boyunca kültive edilmiştir. Bu protokol, bir model sistem olarak hava yolu bronş kullanarak iken, diğer organlarda mukozal birimlerinin 3B birlikte-kültür için bir platform olarak adapte edilebilir.
Doğal ECM'ye benzer yapısal özelliklere sahip polimer lifleri electrospin yeteneği, bu ortamları yeniden electrospun olan bir çok doğal ya da sentetik polimerler ya da polimer harmanları yol açmıştır. Geleni etkisi iskele özelliklerine (polimer seçimi, polimer konsantrasyonu, çözücü, iğne ucu mesafesi ve sıcaklık dahil) işlem parametrelerinin Manipülasyon; ancak bazı parametreler, diğerlerinden 25 den iskele özelliklerine büyük bir etkiye sahip olabilir. PET lif çapı modifiye zaman, kullanılan polimerin konsantrasyonu, polimer çözeltisi electrospun olduğu hızı ve iğne çapı için anahtar parametreler bulundu. Hizalanmış lifleri elektrospinning zaman anahtar parametreleri (dönen mandrel) kullanılan toplama yöntemi ve hızda mandrel döndüğü vardır. 60 rpm mandrel hızını azaltarak sayesinde, üretilen rastgele hizalanmış iskeleleri daha iskele uni gösterdi bulunduuyumunun düz kollektör plaka üzerine elektrospinning karşılaştırıldığında.
Decellularized havayolu dokusunun özellikleri, her havayolu hücre tipi kültürü için geliştirilen çeşitli iskele topografyalarına için rehberlik sağlamak için analiz edildi. Electrospun nanolifler hücre hareketini önleyen ve aynı zamanda artan metabolit difüzyonu için izin veren küçük bir gözenek boyutu, ancak yüksek oranda gözenekliliğine bağlı bazal membran yapıları çoğaltmak için çekici bir skafold olup. 9 elektro parametrelerini optimize ederken, PET konsantrasyonları ve akış oranlarının bir dizi test edildi. ince lifler, daha önce diğer gruplar tarafından kullanılan bir% 6 ağırlık / hacim PET çözeltisi kullanılarak elde edilmiştir. Ancak, yüksek boncuk düzeyleri ve tekdüzelik eksikliği sürekli sorunlar vardı. Boncuk kaldırmak için ilk girişimleri çeşitli kaynaklardan yüzey gerilimini düşürmek için çözeltiye, bir katyonik yüzey aktif madde, setiltrimetilamonyum bromür (CTAB), ekleme ve test dahilPET. surfaktan eklenmesi değil tamamen boncuk miktarı azalır. TFA çözücü solüsyonu: PET peletlerinin ticari kaynaklardan çok sayıda denemeden sonra, gıda sınıfı içecek şişesi PET içecek şişeleri kesme ve DCM içindeki bu çözülmesiyle kullanılmıştır. PET kaynağı fiber homojenliğini bir artış ve elyaf boncuk bir azalma ile sonuçlandı olarak kullanılması. Ağ / hac% 8 hafifçe Çözelti konsantrasyonu artar ve (23 g kadar 18G) İğne çapının azaltılması ile sürekli olarak yaklaşık 250 nm arasında bir lif çapına sahip hatasız nanolifler üretti. Electrospun Nanofiber iskeleleri zor iskelelerinin manuel kullanım yapım mandrelden koleksiyonunda üzerine yüksek elektrostatik olabilir. Bu eğirme ve kullanılmadan önce% 70 IMS ile yıkadıktan sonra, alüminyum folyo içine iskeleleri depolamak sureti ile geliştirilmiştir. Bu Elektrospinning işleminden iskele üzerinde kalan artık elektrostatik yük dağıtmak yardımcı olmak için ortaya çıktı.
Üst sağlamakyavaş yavaş, rastgele hizalanmış nanolifler oluşturulan düşük konsantrasyon PET çözümü elektrospinning: kaynakçalara hava yolu duvarının içinde üç ana havayolu hücre tipleri karşılaştığı bireysel mikroçevrelerde benzer bir temel elektrospinning protokolü bu hücre tipleri için üç benzersiz iskeleleri üretmek için uyarlanmıştır Üzerine epitel hücreleri (RBM taklit) ekilmiştir. Daha hızlı bir oranda daha yüksek bir konsantrasyonu, PET solüsyonundan electrospinning tarafından rastgele hizalanmış mikroelyaflar (daha gözenekli iskele üreten), içine fibroblastlar (RBM hemen altındaki alt-mukoza alan taklit) ekilmiştir oluşturulmuştur. Mandrel hizalanmış nanolifler dönen yüksek hızlı üzerine düşük bir konsantrasyonu, PET solüsyonundan electrospinning olarak, lif yönünde yönlendirilmiş düz kas hücrelerinin hücre yaprak hizalanmış üretilmesi, bunun üzerine, elde edilmiştir.
Artan lif çapı daha büyük hücre penetratio sağlayan artan gözenek boyutuna yoln iskelelerinin içine ve böylece, gerçek bir 3D ortamı oluşturmaya yardımcı olur. Mikrofiber iskeleleri hücrelerin iskele içinde birden düzlemlerde ikamet sağlamak için çalışmaya fibroblastların kültürü için kullanılmıştır. % 30 ağırlık / hacim PET konsantrasyonunu arttırarak, 2.5 um arasında bir ortalama çapa sahip PET lifler üretilmiştir. Daha çaplı elyafı (≈ 4 um)% 35 ağırlık / hacim, PET çözeltisi kullanılarak üretilmiştir, ama skafold kalınlığı homojenliği kayboldu ve tek tek lifler arasındaki yüksek farklılıklar belirgin oldu. Mikro fiber iskele gözenekler (sırasıyla 1.43 mikron vs 10.45 uM) nano iskeleleri ölçülenlerden daha 7 kat daha fazla, ama hücrelerin de statik tohumlama sınırlı hücre penetrasyonu sağlanır. Bu, dinamik bir orbital bir karıştırıcı, daha önce etkili olduğu gösterilmiştir bir yöntem kullanılarak tohum hücreleri ile iyileştirildi.
Son derece uyumlu Nanofiber iskeleleri 10% elektrospinning tarafından oluşturulanağırlık / mandrel üzerine hacim PET çözümü 2,000 rpm'de dönen (≈ 440 m min -1). PET konsantrasyonu elyaflar daha düşük konsantrasyonlarda sergilenen düzensiz bir dalga şeklinde bir yapıya önlemek için% 8 den yükseltilmiştir. Lifleri hizalamak konsantrasyonda artışa rağmen, (rastgele genel hizalanmış 216 nm genel 255 nm), ortalama elyaf çapı azalır. Kuruyan önce lifleri çekme mandreline yüksek hızda bu etkiye neden olması muhtemeldir. liflerin uyum ASM hücrelerinin uyum etkiledi ve aynı zamanda başka bir yerde, 21 karakterize edilmiştir ASM hücreleri üzerinde diğer fizyolojik etkileri vardır.
Bu protokolün en önemli sınırlama örnekleri ödün vermeden belirlemek mümkün uzun bir süre boyunca ilk hücre eki veya ayrıma iskeleleri / 'görüntü canlı hücrelere yetersizliğidir. Yani düzeltmek; Bu en iyi duruma getirme kültür döneminden sonra ortaya çıkar demektirörnekleri ing ve daha sonra, hücre kültürü, hücre kültürü sırasında sonra değil başarılı olup olmadığını ölçmek. (Pembe mavi) AlamarBIue inkübe iskeleler bir renk değişimi gözlemlemek hücreleri mevcut ve yaşayabilir gösterir ama ideal değil. Jelatin gibi elektrospinning daha şeffaf polimerler iskelelerinin üzerinde hücrelerin görselleştirme yardımcı olabilir. Bizim modeli içinde bir nanofibröz iskele Elektrospinning benzer epitel hücreleri ikamet hangi yoğun nanolifler oluşan hava yolu RBM'nin çoğaltma, izin verdi. Bu, daha önce immün hücreleri (veriler gösterilmemiştir) mümkün olmakla birlikte, yapısal hücreler, nano iskele 22 boyunca geçiremez gösterilmiştir. 3B yüzeyi üzerinde spesifik hücre tiplerinin kültür avantajlı iken (epitelyal ve endotelyal hücreleri gibi), nano yoluyla yapısal hücre göçü, bu koruma, diğer hücre tipleri kültürü için zararlı olabilir. Düz kas th yoluyla göç edemiyor gibiE hizalanmış nano skafold (İki hücre tipleri ayırma hizalanmış iskele karşı) birbirine bakan düz kas ve fibroblast tabakaları ile üç tabakalı birlikte-kültür toplandı. Bu hücreler yakın appozisyon içinde olmasını sağlar iken, bu çalışma bir hücre tipi (fibroblast veya düz kas ya) daha uzun bir süre boyunca bütün kültür katmanı sollamak edip sonuçlandırmak olamaz. Bu kısıtlamalara rağmen, hava yolu duvarının uygun bir üç katmanlı modeli bu çoklu hücre türleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için alternatif bir platform sağladığı geliştirilmiştir. Fibroblastlar bir lümen yüzeyi 17 içinde dış yüzey ve epitel hücreleri üzerinde tohumlandı düz kas hidrojel silindirik kollajen içinde gömülmüş olduğu benzer bir üç-tabakalı bir çalışma yakın zamanda yayımlanmıştır. içindeki boru şeklinde sağlayacak Burada geliştirilen electrospun iskelelerinin mekanik stabilite oluşturulacak oluşturur, ve bir akım resea kalırrch Grubumuzun içinde hedefliyoruz. Çalışma bu çalışmada vurgulanan, vücut payı içinde birkaç organları bu temel mukozal yapısal birim ve kiracı değiştirme yoluyla hava yolu odaklanmıştır iken, benzer platformlar kan damarları, mesane ve dahil olmak üzere bazal membran ünitesi içeren dokular için geliştirilmiş olabilir kolajen bazlı çok katmanlı modeller istihdam edilmiştir kornea,.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |