Orthotopique Implantation et périphérique des cellules immunitaires surveillance dans le modèle II-45 Syngénique Rat mésothéliome
Summary
La génération d'un modèle de rat orthotopique du mésothéliome pleural malin par implantation des II-45 cellules de mésothéliome dans la cavité pleurale de rats immunitaires compétentes est présentée. Un procédé de cytométrie de flux pour analyser les sept sous-ensembles de cellules immunitaires chez ces animaux à partir d'un échantillon de sang 25 ul est également décrit.
Abstract
L'énorme regain d'intérêt dans les traitements à base immunitaire contre le cancer tels que les vaccins et les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire, et une meilleure compréhension du rôle du microenvironnement de la tumeur dans la réponse au traitement, pointez sur la nécessité pour les modèles orthotopiques immunitaire compétentes pour les essais pré-cliniques collectivement de ces nouvelles thérapies. Cet article montre comment établir un modèle de rat immunitaire compétent orthotopique du mésothéliome pleural malin. Suivi progression de la maladie dans des modèles orthotopiques se confond interne par l'emplacement des tumeurs. Pour surveiller longitudinalement progression de la maladie et ses effets sur cellules immunitaires circulantes dans ce domaine et d'autres modèles de rats de cancer, un seul tube cytométrie de flux dosage ne nécessitant que 25 ul de sang entier est décrite. Ceci permet d'obtenir une quantification précise de sept paramètres immunitaires: les lymphocytes totaux, monocytes et neutrophiles, ainsi que les sous-ensembles de cellules T CD4 et CD8, les cellules B et les cellules tueuses naturelles. Différents sous-marinsets de ces paramètres sont utiles dans des circonstances et des modèles différents, avec le rapport des neutrophiles à des lymphocytes ayant la plus grande utilité pour le suivi de progression de la maladie dans le modèle de mésothéliome. Analyser les taux circulants de cellules immunitaires en utilisant cette méthode de tube unique peut également aider à surveiller la réponse aux traitements à base immunitaire et de comprendre les mécanismes sous-jacents menant à la réussite ou l'échec du traitement.
Introduction
Le mésothéliome malin (MM) est une tumeur maligne agressive qui se pose à partir de cellules transformées dans la membrane (mésothélium) que les lignes les poumons et la cavité abdominale, le coeur et les organes génitaux internes, et est la tumeur primaire la plus fréquente de la cavité du poumon ou de la plèvre 1,2 . L'exposition aux fibres d'amiante représente 80% de tous les MM, et tandis que les interdictions sur utilisation de l'amiante ont été introduits il ya plusieurs décennies dans la plupart des pays occidentaux, son utilisation répandue dans la communauté a laissé un héritage mortel. L'Organisation mondiale de la santé a estimé que 107.000 personnes dans le monde meurent chaque année de maladies liées à l'amiante, avec des taux de mortalité continue d'augmenter. Une nouvelle vague d'incidence non professionnelle est également en train d'émerger et il ya peu de compréhension de quand, et à quel niveau ce sera à son maximum 3.
La majorité des gens atteints de MM sont diagnostiqués tardivement lorsque la chimiothérapie systémique représente une des seules options viables 4. Les plupart des effective chimiothérapie et de courant standard de soins "(pemetrexed association avec le cisplatine 5) a été identifié il ya plus de 10 ans. Cependant l'échec de ce traitement est inévitable et il n'y a pas des options de seconde ligne éprouvées, laissant les patients avec un pronostic sombre et la survie médiane de 12 mois seulement 2. Par conséquent, il ya un besoin non satisfait urgent de traitements plus efficaces. Malgré l'examen d'un certain nombre de nouvelles thérapies dans des essais cliniques aucune n'a abouti à des changements dans la pratique. Cela est dû en partie à la faible (5%) le transfert des résultats pré-cliniques, généralement effectuée dans des modèles de xénogreffe de souris, pour le réglage de la clinique 6-8. De tels modèles ne récapitulent pas fidèlement les aspects complexes du microenvironnement tumoral se produisant dans les zones non physiologiques, souvent en l'absence d'un système immunitaire fonctionnant 9.
Orthotopiques modèles syngéniques créent un environnement de la tumeur significativement plus réaliste que le commonly utilisé des modèles de xénogreffes sous-cutanées que les tumeurs se produisent dans l'emplacement physiologique correcte avec un système immunitaire 10,11 intacte. La grande taille du rat améliore son utilisation comme modèle de la maladie des rongeurs, en particulier dans les études sur les médicaments où le sang de série tire sont nécessaires pour évaluer la réponse au traitement et la toxicité 12. De plus, dans des modèles dans lesquels la surveillance de la maladie est la progression difficile en raison de l'emplacement des tumeurs (par exemple dans la cavité pleurale), la capacité de surveiller la progression de la maladie en utilisant des facteurs présents dans la circulation est extrêmement attrayant. La génération d'un modèle orthotopique syngénique de mésothéliome pleural en utilisant des rats immuno-compétentes est décrite. En outre, un procédé relativement simple et non invasif de surveillance de progression de la maladie en mesurant pleural cellules immunitaires circulantes est également décrite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article détaille une méthode pour la génération d'un modèle orthotopique syngénique de rat de mésothéliome pleural et une méthode simple pour surveiller la progression de la maladie grâce à un échantillonnage de sang longitudinale.
Le modèle II-45 a été développé par l'exposition des rats Fischer 344 aux fibres d'amiante 13. Bien que cette exposition représente les vrais dynamique des interactions du système hôte-amiante-immune pour le mésothé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.
Materials
| EDTA Collection tube (0.5ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount™ Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1mL Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur™ 4 colour | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
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