आण्विक जांच अनुकूलन (संश्लेषक जीव में सेल मृत्यु दर निर्धारित करने के लिए<em> Microcystis aeruginosa</em>) फ्लो का प्रयोग
Summary
माइक्रोबियल आबादी समग्र व्यवहार निर्देशित कर सकते हैं जो पर्याप्त सेल विविधता, होते हैं। फ्लो के माध्यम से आण्विक जांच विश्लेषण हालांकि अपने आवेदन प्रजातियों के बीच होती है, कोशिकाओं के शारीरिक राज्यों निर्धारित कर सकते हैं। इस अध्ययन underestimating या झूठी सकारात्मक परिणाम रिकॉर्डिंग के बिना, सही ढंग से एक साइनोबैक्टीरीयम आबादी के भीतर सेल मृत्यु दर निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Abstract
क्षेत्र और प्रयोगशाला अध्ययन में माइक्रोबियल उप-जनसंख्या रूपात्मक और शारीरिक मापदंड में उच्च विविधता प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। रोगाणुओं कोशिका विभाजन और चयापचय गतिविधियों को कम कर रहे हैं जिससे एक निष्क्रिय अवस्था में मौजूद कर सकते हैं के रूप में एक माइक्रोबियल सेल की वास्तविक समय राज्य का निर्धारण, जीवित या मृत श्रेणियों से परे चला जाता है। कुल आबादी व्यवहार्यता का निर्धारण करने में मदद करने के लिए एक तेजी से और सही विधि आणविक जांच के साथ पता लगाने और रोगाणुओं की मात्रा का ठहराव के लिए की जरूरत है, cytometry (FCM) प्रवाह प्रदान करता है को देखते हुए। झिल्ली अखंडता का पता लगाने के लिए मॉडल सायनोबैक्टीरिया में Microcystis aeruginosa Sytox ग्रीन और Sytox ऑरेंज उपयोग करके, हम एकल कोशिका मृत्यु दर में तेजी से संकेत के लिए एक हस्तांतरणीय विधि का विकास। कार्रवाई का एक तुलनीय मोड है कि इसी तरह की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ अन्य उत्पादों रहे हैं, हालांकि इस पत्रिका के भीतर इस्तेमाल आणविक जांच (क्रमशः के रूप में हरे या नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच के लिए भेजा जाएगासामने जांच उल्लेख n करने के लिए, हम विशेष रूप से) का उल्लेख है। आणविक जांच का उपयोग कर प्रोटोकॉल एकाग्रता और ऊष्मायन समय में मुख्यतः भिन्न प्रजातियों के बीच बदलती हैं। M.aeruginosa पर निकल पड़े इस प्रोटोकॉल के बाद हरी न्यूक्लिक एसिड जांच 30 ऊष्मायन के मिनट और 10 मिनट के बाद 1 माइक्रोन पर नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच के बाद 0.5 माइक्रोन की सांद्रता में अनुकूलित किया गया था। झिल्ली क्षति के साथ कोशिकाओं की रिपोर्टिंग के तहत एक करने के लिए नेतृत्व कहा इष्टतम से कम दोनों जांच सांद्रता में। इसके विपरीत, दोनों जांच में 5 माइक्रोन सांद्रता और उच्च 'जी' 'कोशिकाओं अलाभकारी' सेल नंबर के एक से अधिक प्रतिनिधित्व करने के लिए अग्रणी लक्ष्य प्रतिदीप्ति का उत्पादन किया है जिसके तहत गैर विशिष्ट धुंधला का एक प्रकार का प्रदर्शन किया। नियंत्रण पीढ़ी के औचित्य बहस का विषय बनी हुई है, हालांकि सकारात्मक नियंत्रण (गर्मी मारे गए), परीक्षण योग्य मृत बायोमास प्रदान की है। हरे और नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच हम डी के अनुकूलन के लिए कदम के एक तार्किक अनुक्रम प्रदर्शन करकेप्रभावी ढंग से cyanobacterial शारीरिक स्थिति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक प्रोटोकॉल बनाने के लिए कैसे monstrate।
Introduction
सेल लगातार शारीरिक मापदंड को संशोधित करने और अपने कार्य को बदलकर वातावरण का जवाब है, जो एक जटिल प्रणाली है। 3 – isogenic माइक्रोबियल आबादी प्रकृति में और प्रयोगशाला दोनों की जनसंख्या गतिशीलता भी अपेक्षाकृत स्थिर पर्यावरण की स्थिति 1 के तहत होने वाली है, उप-जनसंख्या के विकास से प्रभावित हैं। प्राकृतिक माइक्रोबियल समुदायों की परिवर्तनशीलता के कारण पर्यावरण की स्थिति का अत्यधिक परिवर्तनशील प्रकृति के लिए उठता है। ये कभी कभी stochastic प्रक्रियाओं बाद में आबादी औसत करने के लिए बहुत अलग हैं कि उप-जनसंख्या का उत्पादन। हाल ही में सबूत इन शारीरिक उप-जनसंख्या पर्यावरण की स्थिति के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया और नाटकीय रूप से प्रभावित करते हैं और कुल जनसंख्या 3,4 को प्रभावित करने वाले संकेत यौगिकों या अवरोधकों उत्पादन कर सकते हैं कि पता चला है।
आबादी के भीतर विविधता को परिभाषित करने के लिए एक विधि की स्थापना के लिए संयुक्त राष्ट्र की कुंजी हैविभिन्न वातावरण में रोगाणुओं की पारिस्थितिकी derstanding और heterocysts की तरह विशेष कोशिकाओं के विकास, पर्यावरण के उतार-चढ़ाव के जवाब में रूपात्मक विविधता को प्रदर्शित जो भारी प्रभाव डालता है मानव जल सुरक्षा पर। प्रजाति ऐसी Anabaena के रूप में विषाक्त Microcystis, के रूप में, उपद्रव साइनोबैक्टीरीया के ज्ञान का निर्माण जब आवश्यक है और akinetes 2। इसके विपरीत, Microcystis कोशिकाओं में एक तनाव प्रतिक्रिया के दौरान स्पष्ट रूपात्मक विविधता प्रदर्शित नहीं करते। व्यवहार्य और अलाभकारी कोशिकाओं के बीच भेदभाव शारीरिक भेदभाव का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है और माइक्रोबियल जनसंख्या गतिशीलता का एक बेहतर समझ की अनुमति देता है। हालांकि, बैक्टीरियल व्यवहार्यता के ही वैचारिक समस्या मुश्किल और खराब 1,5,6 विशेषता बनी हुई है।
प्रवाह cytometry (FCM) व्यक्तिगत कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय और तेजी से विधि है। एकल कक्ष फिजियो की समझ बढ़ाने के लिएFCM के माध्यम से सना हुआ, आणविक जांच चयापचय और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं 7 के एक नंबर भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह एक सेलुलर और जनसंख्या के स्तर पर प्रजातियों की वृद्धि हुई ज्ञान के लिए नेतृत्व किया और बदले में जल संसाधन प्रबंधन 8,9 में मदद मिली है। हालांकि, जीवों की वजह से आणविक जांच डिजाइन और प्रोटोकॉल कार्यान्वयन 6,10,11 के एक नंबर करने के लिए नेतृत्व किया है, जो सेलुलर दीवारों और झिल्ली के छिद्रों और पंप, आणविक जांच तेज और तपका के मामले में भिन्न होते हैं। वाणिज्यिक और अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उपलब्ध आणविक जांच अक्सर एक बहुत ही अलग सेल प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है जो एक सामान्य प्रोटोकॉल के साथ आपूर्ति की जाती है। एक दूसरे से 6 एक प्रकार की कोशिका के लिए विकसित प्रोटोकॉल को स्थानांतरित करने में बहुत सावधान रहना होगा, इसे प्रभावी ढंग से उपयोग करने से पहले आणविक जांच अनुकूलन करने के लिए एक आवश्यक कार्य इसलिए है।
हरे और नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच न्यूनतम आधार के साथ डबल और सिंगल फंसे न्यूक्लिक एसिड दोनों के लिए बाध्य चयनivity और कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली अखंडता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हरी न्यूक्लिक एसिड जांच भी सेल व्यवहार्यता का एक संकेतक के रूप में कार्य कर सकते हैं, जो इस तरह propidium आयोडाइड आधारित यौगिकों के रूप में 12 अन्य आणविक जांच, की तुलना में एक स्पष्ट रूप से सुधार सेल लेबलिंग प्रतिदीप्ति संकेत है। शब्द 'सेल व्यवहार्यता' यहाँ डीएनए गिरावट प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के नुकसान के बाद होता है कि मानता है। न्यूक्लिक एसिड जांच तीन सकारात्मक आरोपों के साथ भोंडा जाती रंजक हैं और दोनों यूकेरियोटिक 11,13 और प्रोकार्योटिक 14,15 जीवों में, विशेषता सांद्रता के तहत बरकरार झिल्ली के साथ कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकते हैं। न्यूक्लिक एसिड के लिए एक न्यूक्लिक एसिड जांच के बंधन उनकी झिल्ली अखंडता समझौता है कि कोशिकाओं में अंतर्जात संकेतों से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का एक> 500 गुना वृद्धि करने के लिए हो सकता है। ऐसे हरी न्यूक्लिक एसिड जांच के रूप में आणविक जांच एकल कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान का एक अच्छा संकेत हो सकता है, एक की जरूरत है टीअकेले Microcystis प्रयोगों में 0.5 माइक्रोन 15 – – 0.1 माइक्रोन से 30 मिनट और एकाग्रता पर्वतमाला – 19 ऊष्मायन बार 7 मिनट से अलग है के रूप में ओ, इच्छित लक्ष्य जीव के साथ हर जांच का अनुकूलन।
यहाँ हम हरे रंग की cytometric assays और (तारीख को cyanobacterial प्रजातियों M.aeruginosa पर परीक्षण नहीं किया गया है) अपेक्षाकृत नई नारंगी न्यूक्लिक एसिड जांच अनुकूलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। निम्नलिखित विकसित पद्धति तो अन्य प्रजातियों को हस्तांतरित करने और इस तरह के रोगाणुओं की समझ और उनके पारिस्थितिक व्यवहार बढ़ रही है, अन्य आणविक जांच में प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
15,19,22,23 – आणविक जांच का उपयोग प्रकाशनों की बढ़ी संख्या विश्वसनीय और जानकारीपूर्ण डेटा 5,6,8 प्राप्त किया जा सकता है कि इंगित करता है। अभी तक के रूप में एक ही एकाग्रता और ऊष्मायन समय 6,10 के साथ स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों अनुसंधान और सुविधाओं के लिए समर्थन और धन के लिए पीएचडी के छात्र डेव Hartnell और बोर्नमाउथ विश्वविद्यालय को स्वीकार करना होगा।
Materials
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min. Followed by 2mins of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A (by request) | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
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