光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（<em>アオコ緑膿菌</em>）フローサイトメトリーを使用して

Summary

微生物集団は、全体的な動作を決定することができる実質的な細胞の不均一性を、含まれています。フローサイトメトリーを介して、分子プローブ分析は、細胞の生理的状態を決定することができ、しかし、そのアプリケーションは、種間で変化します。本研究では、偽陽性の結果を過小評価または記録することなく、正確にシアノバクテリアの集団内の細胞の死亡率を決定するためのプロトコルを提供します。

Abstract

微生物分野での亜集団と実験室での研究は、形態学的および生理学的パラメータに高い不均一性を示すことが示されてきました。微生物が細胞分裂および代謝活性が低下していることにより休眠状態で存在することができるように微生物細胞のリアルタイムの状態を決定することは、生死のカテゴリーを超えました。微生物の検出および定量化の必要性を考えると、分子プローブを用いたフローサイトメトリー（FCM）は、集団全体の生存率を決定するのを助けるために迅速かつ正確な方法を提供します。膜の完全性を検出するためのモデルシアノバクテリアのMicrocystis aeruginosaのでSYTOX緑とSYTOXオレンジを使用することにより、我々は単一細胞死亡率の急速な適応のための譲渡方法を開発。 actioの同等のモードを有する類似の励起波長および発光波長を有する他の製品があるが、このジャーナル内で使用される分子プローブは、（それぞれ緑またはオレンジ核酸プローブと称しますnは、我々は、具体的に前面に参照）プローブを述べました。分子プローブを使用したプロトコルは濃度およびインキュベーション時間で、主に異なる、種間で変動します。 M.aeruginosaに出るこのプロトコルに続いて緑の核酸プローブは、10分後に1μMで30インキュベーションの分とオレンジの核酸プローブの後、0.5μMの濃度で最適化しました。両方のプローブで述べた最適未満の濃度は、膜の損傷による細胞の下に報告につながりました。逆に、両方のプローブで5μMの濃度と高いが「非生存」細胞数の過剰表現につながる、「ライブ」細胞が標的の蛍光を生成することにより非特異的な染色の種類を示しました。ポジティブコントロール（加熱殺菌）コントロールの生成の妥当性が議論の対象に残るものの、検証可能な死んだバイオマスを提供しました。我々はデ・緑とオレンジの核酸プローブを最適化するためのステップの論理的順序を実証することにより、効果的にシアノバクテリアの生理学的状態を分析するために使用できるプロトコルを作成する方法monstrate。

Introduction

細胞は常に生理的パラメータを変更し、その機能を変化させることにより環境に応答する複雑なシステムです。 ^{3 –}同質遺伝子の微生物集団の個体群動態自然の中で、実験の両方が比較的一定の環境条件下でさえ^1を発生する、亜集団の発展によって影響されます。自然の微生物群集の多様性は、環境条件の非常に可変性に起因して生じます。これら時々確率過程はその後、人口の平均に非常に異なっている部分集団を生成します。最近の証拠は、これらの生理学的な亜集団は、環境条件に異なった反応をし、劇的に影響し、全体的な人口の^{3,4に影響を与える}シグナル化合物または阻害剤を産生することができることを明らかにしました。

集団内の異質性を定義するための方法を確立することは、国連への鍵ですなどなどアナベナなどの種は異質のような特殊化した細胞を開発し、環境変動に応じて、形態学的不均一性を示す人間の水の安全保障に大きく影響を与える。有毒アオコなど、様々な環境での微生物の生態をderstandingと迷惑シアノバクテリアの知識を構築する際に不可欠ですそして、akinetes ^2。これとは対照的に、 アオコ細胞は、ストレス応答の間に明らかな形態学的な不均一性を表示しません。実行可​​能と非生存細胞との区別は、生理的分化の最も重要な側面であり、微生物の個体群動態をよりよく理解することができます。しかし、細菌の生存率そのものの概念の問題は難しいと特徴付けが乏しい^1,5,6のまま。

フローサイトメトリー（FCM）は、個々の細胞を分析の信頼性が高く、迅速な方法です。単一細胞生理の理解を高めるためにFCMスルーでれっと、分子プローブは、代謝および生化学的プロセス⁷の数を区別するために使用されてきました。これは、携帯電話や人口レベルでの種の増加の知識につながったし、今度は水資源管理^8,9を支援してきました。しかし、生物は、分子プローブ設計およびプロトコル実装^6,10,11の数につながっている携帯壁や膜中の細孔やポンプ、に分子プローブの取り込みと排出の点で異なります。商業用および研究目的のために利用可能な分子プローブは、しばしば、非常に異なる細胞型にも適用可能である一般的なプロトコルを用いて供給されています。一つは、別の⁶に一つの細胞型のために開発されたプロトコルを転送するのに非常に慎重でなければならない、それは、したがって、効果的に使用する前に分子プローブを最適化するために不可欠な作業です。

緑とオレンジの核酸プローブは、最小限のベースとのダブルと一本鎖核酸の両方に結合し選択ivityとは、細胞の原形質膜の完全性を評価するために使用されます。緑色の核酸プローブは、また、細胞生存率の指標として機能することができるヨウ化プロピジウム系化合物¹²のような他の分子プローブに比べて著しく改善された細胞標識蛍光シグナルを有します。ここで用語「細胞生存率は、「DNA分解は、原形質膜完全性の喪失後に発生することを想定しています。核酸プローブは、3つの正電荷を有する非対称シアニン色素であり、真核生物の^11,13および原核生物^14,15の両方で、特徴づけられた濃度の下で、無傷の膜を有する細胞を入力することはできません。核酸に核酸プローブの結合は、それらの膜完全性が損なわれている細胞における内因性信号からの蛍光発光の> 500倍の増加までをもたらすことができます。このような緑色の核酸プローブとして分子プローブは、単一の細胞生理学の良い指標となることができますが、必要性のトンがありますだけではアオコの実験では^{0.5μM15 –} – 0.1μMから30分であり、濃度範囲- ¹⁹インキュベーション時間は7分まで変化させてきたように、O、目的の標的生物に各プローブを最適化します。

ここでは、緑のサイトメトリーアッセイと（これまでにシアノバクテリア種M.aeruginosa上でテストされていない）比較的新しいオレンジ色の核酸プローブを最適化するためのプロトコルを提示します。次の発展の方法は、他の種に移し、それによって微生物およびそれらの生態行動の理解を増加させる他の分子プローブでプロトコルを最適化するためのプラットフォームとして使用することができます。

Protocol

分子プローブおよびフローサイトメーターの作製超純濾過H 2 Oに必要な濃度のアリコートにジメチルスルホキシド（DMSO）中の5 mM溶液として供給されている核酸プローブのストック溶液を希釈 25°Cの使用まで- -5°Cの間の暗いところでの核酸プローブを保管してください。 フローサイトメーターおよびロード・ソフトウェア・パッケージ（FCM仕様の…

Representative Results

対数期におけるM.aeruginosaのバッチ培養からの前方光散乱（FSC）および側方光散乱（SSC）出力は、それぞれのセルの大きさ（直径）と内部粒度に関する情報（ 図1A）を提供します。 FSCはM.aeruginosaことには大きすぎるおよび/ ​​または小である細胞を識別することができます。この差別またはゲーティングはFSC出力（ 図1C）の特定…

Discussion

^{15,19,22,23 –}分子プローブを使用して出版物の増加した数は、信頼性が高く、有益なデータが^5,6,8を得ることができることを示しています。まだのと同じ濃度およびインキュベーション時間^6,10を持つすべての種にわたって有効であることができる細胞の生存率には完璧な汚れがありません。変更された蛍光発光を有するプローブであっても同じタイプが正しい濃…

Materials

Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min.  Followed by 2mins of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	N/A (by request)	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO