Molecular Probe Optimization fastslår Cell Dødelighet i en Photosynthetic Organism (<em> Microcystis aeruginosa</em>) Ved hjelp av flowcytometri

Summary

Mikrobepopulasjoner inneholde betydelig celle heterogenitet, som kan diktere generelle atferd. Molekylær sonde analyse gjennom flowcytometri kan avgjøre fysiologiske tilstander av celler, men sin søknad varierer mellom artene. Denne studien gir en protokoll for å fastslå nøyaktig celle død innen et cyanobacterium befolkning, uten å undervurdere eller opptak falske positive resultater.

Abstract

Mikrobielle subpopulasjoner i felt- og laboratoriestudier har vist seg å vise høy heterogenitet i morfologiske og fysiologiske parametre. Bestemme sanntid tilstand av en mikrobiell celle går utover levende eller døde kategorier, som mikrober kan eksistere i en sovende tilstand, der celledeling og metabolske aktiviteter er redusert. Gitt behovet for deteksjon og kvantifisering av mikrober, strømningscytometri (FCM) med molekylære prober gir en hurtig og nøyaktig metode for å bestemme totalpopulasjonen levedyktighet. Ved å bruke SYTOX Grønn og SYTOX Orange i modellen cyanobakterier Microcystis aeruginosa å påvise membran integritet, utvikler vi en overførbar metode for rask indikasjon på enkelt dødelighet celle. De molekylære prober som brukes i dette tidsskriftet vil bli referert til som en grønn eller orange nukleinsyre-prober som henholdsvis (selv om det er andre produkter med lignende eksitasjons- og emisjonsbølgelengder som har en sammenlignbar måter aktion, vi henviser spesielt i forgrunnen nevnt prober). Protokoller ved hjelp av molekylære prober varierer mellom arter, ulik hovedsakelig i konsentrasjons og inkuberingstider. Etter denne protokollen satt ut på M.aeruginosa den grønne nukleinsyre-probe ble optimalisert ved konsentrasjoner på 0,5 um etter 30 min inkubering, og den oransje nukleinsyre-probe på en pM etter 10 min. I begge probes konsentrasjoner mindre enn oppgitt optimal ført til en underrapportering av celler med membranskade. Omvendt, 5 uM konsentrasjoner og høyere i begge probene viste en type ikke-spesifikk farging, hvorved førende celler produsert et mål fluorescens, som fører til en overrepresentasjon av "ikke-levedyktig" celleantall. De positive kontroller (varmedrepte) forut testbar død biomasse, selv om hensiktsmessigheten av kontroll generasjon er fortsatt gjenstand for debatt. Ved å demonstrere en logisk sekvens av trinn for å optimalisere de grønne og oransje nukleinsyreprober vi demonstrate hvordan å lage en protokoll som kan brukes til å analysere cyanobacterial fysiologisk tilstand effektivt.

Introduction

Cellen er et komplekst system, som stadig svarer til omgivelsene ved å modifisere fysiologiske parametere, og å endre dets funksjon. Populasjonsdynamikk isogene mikrobielle populasjoner både i naturen og laboratorie påvirkes av utviklingen av subpopulasjoner, som forekommer selv under relativt konstant miljøforhold ^{1 – 3.} Variabiliteten av naturlige mikrobielle samfunn oppstår på grunn av den sterkt varierende natur av miljøforhold. Disse noen ganger stokastiske prosesser senere produsere subpopulasjoner som er svært annerledes enn gjennomsnittsbefolkningen. Nyere bevis har avdekket at disse fysiologiske subpopulasjonene reagerer forskjellig på miljøforhold og kan produsere signal forbindelser eller hemmere som dramatisk påvirker og påvirker den generelle befolkningen ^3,4.

Etablering av en metode for å definere heterogenitet innen en populasjon er nøkkelen til unståelse økologi av mikrober i ulike miljøer, og er viktig når bygger kjennskap til plage cyanobakterier, slik som giftig Microcystis, som påvirker sterkt på human vannsikkerhet. art som Anabaena viser morfologisk heterogenitet i respons til svingninger miljø, utvikle spesialiserte celler som heterocysts og akinetes ^2. I motsetning til dette har Microcystis celler ikke viser tydelig morfologisk heterogenitet i løpet av en stressrespons. Diskrimineringen mellom levedyktige og ikke-levedyktige celler, er det viktigste aspektet av fysiologisk differensiering og tillater en bedre forståelse av mikrobielle populasjonsdynamikk. Men den konseptuelle problemet med bakteriell levedyktighet seg fortsatt vanskelig og dårlig preget ^1,5,6.

Strømningscytometri (FCM) er en pålitelig og rask metode for å analysere individuelle celler. For å øke forståelsen for enkelt celle fysiology gjennom FCM, har molekylære prober blitt brukt til å skille mellom en rekke metabolske og biokjemiske prosesser ^7. Dette har ført til økt kunnskap om arter på celle og befolkningsnivå og i sin tur bidro til vannressursforvaltning ^8,9. Imidlertid organismer forskjellig når det gjelder molekylær probe opptak og utstrømming på grunn av porer og pumper i cellevegger og membraner, som har ført til en rekke molekylær probe utforming og protokoll implementering ^6,10,11. Molekylære prober tilgjengelig for kommersielle og forskningsformål er ofte leveres med et generisk protokoll som kan være aktuelt for en helt annen celletype. Man må være meget forsiktig med å overføre protokoller er utviklet for en celletype til en annen ^6, er det derfor en viktig oppgave å optimalisere molekylære prober effektivt før bruk.

De grønne og oransje nukleinsyreprober binde seg til både doble og enkle nukleinsyrer med minimal basen velgeivity og blir brukt til å vurdere den plasmamembranintegritet av celler. Den grønne nukleinsyreprobe har en markert forbedret cellemerking fluorescens signal sammenlignet med andre molekylære prober, slik som propidiumjodid-baserte forbindelser ^12, som også kan fungere som en indikator på cellelevedyktigheten. Begrepet "cellelevedyktigheten" her forutsetter at DNA degradering oppstår etter tapet av plasmamembranintegritet. De nukleinsyreprober er usymmetriske cyaninfargestoffer med tre positive ladninger og kan ikke gå inn celler med intakt membraner henhold preget konsentrasjoner, både eukaryote ^11,13 og prokaryote ^14,15 organismer. Bindingen av en nukleinsyre-probe nukleinsyrer som kan føre opp til en> 500 gangers økning av fluorescensemisjoner fra endogene signaler i celler som har sitt membranintegritet kompromittert. Selv om molekylære prober som for eksempel grønne nukleinsyreprobe kan være en god indikator på enkeltcellefysiologi, er det et behov to optimalisere hver sonde med den tiltenkte målorganismen, som inkubasjonstider har variert fra 7 min – 30 min og konsentrasjonsområder fra 0,1 pM – 0,5 pM i Microcystis eksperimenter alene ^{15 – 19.}

Her presenterer vi en protokoll for å optimalisere cytometriske analyser av grønt og de ​​relativt nye oransje nukleinsyreprober (som til dags dato ikke blitt testet på cyanobakterielle arter M.aeruginosa). Følgende utviklet metode kan deretter overføres til andre arter, og brukt som en plattform for å optimalisere protokoller i andre molekylære prober, for derved å øke forståelsen av mikrober og deres økologiske oppførsel.

Protocol

1. Klargjøring av Molecular Probe og Flowcytometer Fortynne stamløsninger av nukleinsyre-prober, som leveres som en 5 mM løsning i dimetylsulfoksyd (DMSO) til aliquoter av ønskede konsentrasjoner i ultrarent filtrert H 2 O. Oppbevar nukleinsyreprober i mørke forhold mellom -5 o C og – 25 ° C til bruk. Slå på flowcytometeret og last programvarepakke (se tabell over Materiale / Utstyr for FCM spesifikasjoner). Plasser en tom hemolyse rør (1…

Representative Results

Forward lysspredning (FSC) og side lysspredning (SSC) utganger fra en M.aeruginosa batch kultur i eksponentiell fase gir informasjon om celle størrelse (diameter) og intern detaljnivå henholdsvis (figur 1A). FSC kan diskriminere celler som er for store og / eller små til å være M.aeruginosa. Denne diskriminering eller gating kan gjøres ved raffinering av data mellom visse punkter i en FSC utgang (figur 1C). Phycocyanin, en stor ko…

Discussion

De økte antall publikasjoner bruke molekylære prober indikerer at pålitelige og informative data kan hentes ^{5,6,8 – 15,19,22,23.} Som foreløpig er det ingen perfekt flekken for celle levedyktighet som kan være effektivt på tvers av alle arter med samme konsentrasjon og inkubasjonstid ^6,10. Selv den samme type sonde med endrede fluorescensemisjoner viser et behov for å etablere den riktige konsentrasjon og inkubasjonstiden (tabellene 1 og 3). Som det sees…

Materials

Cyanobacteria Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)
Decontamination Fluid	BD Biosciences	653155	Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min.  Followed by 2mins of sheath H2O.
Flow Cytometer	BD Biosciences	N/A (by request)	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO