Molecular Probe Optimization för att bestämma cell Dödligheten i en Photo Organism (<em> Microcystis aeruginosa</em>) Med användning av flödescytometri
Summary
Mikrobiella populationer innehåller väsentliga cell heterogenitet, som kan diktera övergripande beteende. Molekylär probe analyser genom flödescytometri kan bestämma fysiologiska tillstånd av celler, men dess tillämpning varierar mellan arter. Denna studie ger ett protokoll för att exakt bestämma cell dödlighet inom en cyanobakterie befolkning, utan att underskatta eller spela falskt positiva resultat.
Abstract
Microbial subpopulationer i fält- och laboratoriestudier har visat att visa hög heterogenitet i morfologiska och fysiologiska parametrar. Fastställande av realtids tillståndet hos en mikrobiell cell går utöver levande eller döda kategorier, eftersom mikrober kan existera i ett vilande tillstånd, varvid celldelning och metaboliska aktiviteter minskar. Med tanke på behovet för detektering och kvantifiering av mikrober, flödescytometri (FCM) med molekylära sonder ger en snabb och noggrann metod för att avgöra den totala befolkningen livskraft. Genom att använda Sytox Grön och Sytox Orange i modellen cyanobakterier Microcystis aeruginosa att upptäcka membranintegritet, utvecklar vi en överförbar metod för snabb indikation på en enda cell dödlighet. De molekylära prober används inom den här tidskriften kommer att kallas grön eller orange nukleinsyraprober respektive (även om det finns andra produkter med liknande excitations- och emissionsvåglängder som har en jämförbar sätt action, vi särskilt hänvisar i förgrunden nämnda prober). Protokoll som använder molekylära sönder varierar mellan arter, som skiljer sig huvudsakligen i koncentration och inkubationstider. Efter denna protokoll som anges på M.aeruginosa den gröna nukleinsyrasonden optimerades vid koncentrationer av 0,5 ^ M efter 30 min av inkubation och den orange nukleinsyrasonden på en iM efter 10 minuter. I båda sonder koncentrationer mindre än den angivna optimala lett till en underrapportering av celler med membranskada. Omvänt, 5 pM koncentrationer och högre i båda sonderna uppvisade en typ av icke-specifik färgning, varvid "live" celler producerade ett mål fluorescens, vilket leder till en överrepresentation av "icke-viabla 'cellantal. De positiva kontrollerna (värmeavdödade) gav testbar död biomassa, även om det är lämpligt att kontrollen generation fortfarande föremål för debatt. Genom att visa en logisk följd av åtgärder för att optimera den gröna och orange nukleinsyraprober vi demonstrate hur man skapar ett protokoll som kan användas för att effektivt analysera cyanobakterier fysiologiska tillstånd.
Introduction
Cellen är ett komplext system, som ständigt svarar på miljön genom att modifiera fysiologiska parametrar och att ändra dess funktion. Populationsdynamik av isogena mikrobiella populationer både i naturen och laboratorie påverkas av utvecklingen av subpopulationer, förekommer även under relativt konstanta miljöförhållanden 1 – 3. Variabiliteten av naturliga mikrobiella samhällen uppstår på grund av den mycket varierande naturen av miljöförhållanden. Dessa ibland stokastiska processer därefter producerar subpopulationer som är mycket annorlunda än befolkningen i genomsnitt. Nya rön har visat att dessa fysiologiska delpopulationer reagerar olika på miljöförhållanden och kan producera signal föreningar eller inhibitorer som dramatiskt påverkar och påverka den totala populationen 3,4.
Upprättande av en metod för att definiera heterogenitet inom en population är nyckeln till unelse ekologi mikrober i olika miljöer och är viktigt när man bygger kunskap om olägenhet cyanobakterier, såsom giftiga Microcystis, som påverkar tungt på människors vattensäkerhet. Arter som Anabaena visa morfologiska heterogenitet som svar på miljöförändringar, utveckling av specialiserade celler som heterocysts och akinetes 2. Däremot behöver Microcystis cellerna inte visa uppenbara morfologisk heterogenitet under en stressreaktion. Diskrimineringen mellan viabla och icke-viabla celler är den viktigaste aspekten av fysiologisk differentiering och möjliggör en bättre förståelse av mikrobiella populationsdynamik. Men fortfarande svårt och dåligt kännetecknas 1,5,6 den konceptuella problemet med bakterie lönsamhet själv.
Flödescytometri (FCM) är en pålitlig och snabb metod för att analysera enskilda celler. För att öka förståelsen för en enda cell fysionik genom FCM har molekylära sonder använts för att skilja ett antal metaboliska och biokemiska processer 7. Detta har lett till ökad kunskap om arter på cellulär och befolkningsnivå och i sin tur bidragit till vattenresursförvaltning 8,9. Men organismer skiljer sig i fråga om molekylär sond upptag och utflöde på grund av porer och pumpar i cellväggar och membran, som har lett till ett antal molekylär sond konstruktion och protokollförs 6,10,11. Molekylära prober tillgängliga för kommersiella och forskningsändamål levereras ofta med en generisk protokoll som kan tillämpas på en helt annan celltyp. Man måste vara mycket försiktig med att överföra protokoll som utvecklats för en celltyp till en annan 6, är det därför en viktig uppgift att optimera molekylära sonder effektivt före användning.
Den gröna och orangea nukleinsyrasonder binder till både dubbel- och enkelsträngade nukleinsyror med minimal grund väljivity och används för att bedöma plasmamembranintegritet av celler. Den gröna nukleinsyraprob har en markant förbättrad cellmärkning fluorescenssignal i förhållande till andra molekylära prober, såsom propidiumjodid baserade föreningar 12, vilka även kan fungera som en indikator på cellviabilitet. Uttrycket "cellviabiliteten" här förutsätter att DNA nedbrytning sker efter förlusten av plasmamembranet integritet. Nukleinsyrasondema är osymmetriska cyaninfärgämnen med tre positiva laddningar och kan inte komma in i cellerna med intakta membran enligt kännetecknas koncentrationer i både eukaryota 11,13 och prokaryota 14,15 organismer. Bindningen av en nukleinsyrasond till nukleinsyror kan resultera i upp till en> 500-faldig ökning av fluorescensemissioner från endogena signaler i celler som har sin membranintegritet äventyras. Även om molekylära prober, såsom den gröna nukleinsyraprob kan vara en bra indikator på enkelcellfysiologi, finns det ett behov to optimera varje sond med det avsedda målorganismen, som inkubationstider har varierat från 7 min – 30 min och koncentrationsintervall från 0,1 iM – 0,5 iM i Microcystis experiment enbart 15-19.
Här presenterar vi ett protokoll för att optimera cytometrisk analyserna av grönt och de relativt nya apelsin nukleinsyrasonder (som hittills inte testats på blågrön arten M.aeruginosa). Följande utvecklad metodik kan sedan överföras till andra arter och användas som en plattform för att optimera protokoll i andra molekylära sonder, vilket ökar förståelsen av mikrober och deras ekologiska beteende.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ökade antalet publikationer med hjälp molekylära sonder tyder på att tillförlitliga och informativa data kan erhållas 5,6,8 – 15,19,22,23. Än så länge finns det ingen perfekt fläck för cellviabilitet som kan vara effektiva i alla arter med samma koncentration och inkubationstid 6,10. Även samma typ av prob med förändrade fluorescensemissioner visar ett behov av att etablera den korrekta koncentrationen och inkubationstiden (Tabellerna 1 och 3).</strong…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för doktorand Dave Hartnell och Bournemouth University för stöd och finansiering för forskning och anläggningar.
Materials
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min. Followed by 2mins of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A (by request) | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
Riferimenti
- Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
- Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
- Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
- Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
- Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
- Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
- Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
- Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
- Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
- Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
- Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
- Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
- Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
- Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
- Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
- Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
- Marie, D., Simon, N., Vaulot, D., Andersen, R. A. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. , 253-268 (2005).
- Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
- Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division?. J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
- Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
- Waggoner, A., Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. , 209-225 (1990).
- Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
- Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).
