Questo protocollo descrive un metodo per la fabbricazione di nanoparticelle polimeriche conduttrici miscelate con fullerene. Queste nanoparticelle sono state studiate per il loro potenziale utilizzo come fotosensibilizzatori di nuova generazione per la terapia fotodinamica (PDT).
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Articolo metodologico
Terapia fotodinamica con Blended Condurre Polimero / Fullerene nanoparticelle fotosensibilizzanti
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo articolo viene riportato un metodo per la fabbricazione e la valutazione riproducibile in vitro di nanoparticelle polimeriche conduttrici miscelate con fullerene come fotosensibilizzatori di nuova generazione per la Terapia Fotodinamica (PDT). Le nanoparticelle sono formate dall'interazione idrofobica del polimero semiconduttore MEH-PPV (poli[2-metossi-5-(2-etilesilossi)-1,4-fenilevinilene]) con il fullerene PCBM (estere metilico dell'acido fenil-C61-butirrico) in presenza di un solvente non compatibile. MEH-PPV ha un alto coefficiente di estinzione che porta ad alti tassi di formazione di triplette e a un efficiente trasferimento di carica ed energia al PCBM del fullerene. Questi ultimi processi migliorano l'efficienza del sistema PDT attraverso la formazione di triplette e radicali assistiti da fullerene e la disattivazione ultrarapida di MEH-PPV eccitato. I risultati qui riportati mostrano che questo sistema di sensibilizzazione PDT a nanoparticelle è altamente efficace e mostra una specificità inaspettata per le linee cellulari tumorali.
Introduzione
In Terapia fotodinamica (PDT) fotosensibilizzanti vengono somministrati al tessuto bersaglio, e in seguito all'esposizione alla luce il fotosensibilizzante genera specie reattive dell'ossigeno (ROS). Specie ROS come l'ossigeno singoletto e superossido possono indurre lo stress ossidativo e la conseguente danno strutturale alle cellule e tessuti 1-4. Grazie alla sua facilità di applicazione questo metodo è stato attivamente indagato e gli studi clinici hanno avuto luogo 5,6. Tuttavia, le questioni rilevanti quali la tossicità scuro dei sensibilizzanti, la sensibilità del paziente alla luce (a causa della distribuzione non selettiva de....
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Protocollo
1. la coltura linee cellulari
- Disgelo TE 71 (cellule epiteliali del timo del mouse), MDA-MB-231 (le cellule del cancro al seno umano), A549 (le cellule tumorali del polmone umano) e OVCAR3 (cellule tumorali ovariche umane) tenendo le fiale criogeni in acqua tiepida per meno di 2 minuti . Aggiungere 10 ml supporti DMEM supplementato con 10% FBS per ciascuna linea cellulare e centrifugare per 6 min a 106 x g.
- Aspirare la sospensione e aggiungere dei media da 3 ml al pellet. Mescolare le cellule correttamente pipettando più volte. Aggiungi questa soluzione cella per preriscaldata 7 ml supporti DMEM supplementato con il 10% FBS in fiaschi T75 e tener....
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Risultati
Assorbimento e citotossicità intrinseca di nanoparticelle
Il 50% in peso di blended nanoparticelle MEH-PPV / PCBM sono state incubate con TE 71, MDA-MB-231, A549 e linee cellulari OVCAR3. Il livello PCBM fusione è stato scelto come il 50% in peso PCBM, che ha dimostrato di fornire carica e trasferimento di energia proprietà ideali tra polimeri coniugati e fullereni 14. Immagini di fluorescenza di nanoparticelle assorbimento sono mostrati in figura 1B. Le cellule s.......
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Discussione
Per ottenere nanoparticelle assorbimento era necessario mantenere alcune misure critiche mentre fabbricare nanoparticelle. A 10 -6 M soluzione MEH-PPV (miscelato con il 50% in peso PCBM) in THF era disposto per iniettare in acqua DI, come è stato osservato che la concentrazione di questa soluzione ha un ruolo importante nel determinare le dimensioni di nanoparticelle in formazione. Concentrazione è stata verificata mediante spettroscopia UV-vis. Si noti che nel passaggio 2.1.3 protocollo era necessario diluir.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano la National Science Foundation (NSF) per il sostegno finanziario di questo lavoro attraverso un premio CARRIERA (CBET-0746210) e attraverso il premio CBET-1159500. Vorremmo ringraziare il Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) e il Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) per l'assistenza con la coltura cellulare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Poli[2-metossi-5-(2-etilesilossi)-1,4-fenilenvinilene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | medio Mn 150.000-250.000 |
| [6,6]-fenile C61 estere metilico dell'acido butirrico (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | 99,5% |
| Tetraidrofurano (THF) | EMD | TX0284-6 | Siringa Drisolv |
| da 1 ml | Scientific Company | 37510-1 | Per la filtrazione della soluzione MEH-PPV |
| Filtro per siringa | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0,2 µ m, Siringa in PTFE |
| da 1 ml | Hamilton Company | 81320 | Per l'iniezione di soluzione MEH-PPV in acqua per produrre nanoparticelle |
| Modifica di Dulbecco della miscela Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hank senza rosso fenolo (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1x senza calcio e magnesio (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Siero fetale bovino, regolare (inattivato dal calore) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Tripsina EDTA 1x 0,25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Tripsina/2,21 mM EDTA in HBSS senza bicarbonato di sodio, calcio e magnesio Testato per il parvovirus suino |
| 16% Paraformaldeide | Scienze della microscopia elettronica | 15710 | Il 16% di paraformaldeide viene diluito al 4% aggiungendo PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Colorazione nucleare |
| Pipette da 5 ml | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 pallone di coltura | VWR | 82050-856 | per colture cellulari |
| Piastre a 96 pozzetti | VWR | 82050-771 | per saggi MTT |
| Piastre per colture tissutali con sfiati | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Ioduro di propidio | Sonde molecolari | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | colorante per l'apoptosi |
| Celltiter 96 saggi non-R 1000 | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, per la rilevazione dello stress ossidativo | Invitrogen | C10444 | per ROS spettrometro |
| UV-vis | Agilent 8453 | ||
| spettrometro a fluorescenza | NanoLog HoribaJobin, Yvon | ||
| di diffusione dinamica della luce | , rivelatore | ||
| incubatore | NuAir DH, Autoflow | ||
| microscopio confocale | Zeiss Axioskop2 | 63X, lente dell'obiettivo a immersione in olio | |
| Microscopio a epiluminescenza | Olympus IX71 | 60X obiettivo a immersione in acqua, fotocamera Andor Zyla sCMOS | |
| Simulatore solare | Newport 67005 Oriel Instruments Cella | ||
| solare di riferimento | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Lettore di micropiastre | Emocitometro BioTek Ex808 | ||
| Hausser Scientific Partnership | 3200 | Per il conteggio delle cellule |
Riferimenti
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M.
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Ristampe e permessi
