Incelenmesi Protein Fonksiyonu ve Antikor Girişim ve üç boyutlu Rekonstrüksiyonunda tarafından değiştirilmiş Protein Ekspresyonu Rolü
Summary
Controlling protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions in cellular models. The protocol presented shows the application of antibody interference in mammalian cells including primary hippocampal neurons and demonstrates the use of three-dimensional reconstructions in studying protein function.
Abstract
protein ekspresyonunun bir sıkı yönetim canlı her organizmada gerekli değil, aynı zamanda hücresel modellerinde protein fonksiyonlarını araştırmak için önemli bir strateji değil sadece. Bu nedenle, son araştırmalar RNA ve antikor enterferans dahil memeli hücre hatları, hatta hayvan modellerinde, protein ifadesini hedef için farklı araçlar icat etti. İlk strateji son yirmi yılda çok dikkat toplamıştır ederken, hücresel membranlar boyunca ve hücre içine antikor kargoların bir translokasyon aracılık peptidler, çok daha az ilgi aldı. Bu yayında olarak, antikor müdahale deneyleri gerçekleştirmek için insan embriyonik böbrek hücrelerinde ve primer hipokampal nöronlar Chariot isimli bir peptit taşıyıcı kullanır ve daha fazla protein işlevi analiz üç boyutlu rekonstrüksiyon uygulanmasını göstermek için nasıl ayrıntılı protokol sağlar. Bulgularımız Chariot muhtemelen nükleer lokalizasyon sinyali, Particula için olduğunu göstermektedirrly soma ve çekirdeğinde bulunan proteinleri hedef için çok uygundur. Primer hipokampal kültürlere Chariot uygularken Enteresandır, reaktif şaşırtıcı derecede iyi ayrışmış nöronlar tarafından kabul edilmesi ortaya çıktı.
Introduction
her canlı organizma kendi gelişimini komuta yanı sıra çevresel sinyallere tepki için protein ifade Sıkı denetim esastır. Bu nedenle, mekanizmaların çok sayıda hassas uygulama tarafından kodlanan her protein ifade düzeyini düzenleyen evrim sırasında icat edilmiştir. ömrünün herhangi bir zamanda herhangi bir ökaryotik hücre içinde mevcut olan 20.000 genler. Protein üretimi farklı aşamalarında yer alarak, düzenleyici mekanizmaların posttranslasyonel modifikasyonlar proteini, taşıma ve bozulma yönüne taşıma kromatin yapısının, transkripsiyonu ve RNA yönetim arasında değişir.
Moleküler makine ve değiştirilmiş protein ekspresyon düzeyleri altta yatan de arızaları, kanser ya da zihinsel engelli gibi çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğunu, bu nedenle şaşırtıcı değildir. Nitekim, nöronal gelişim ve memeli beyin fonksiyonlarının olağanüstü karmaşıklığı bakarak, sensiProtein ifadesindeki değişiklikler bu sofistike sistemlerin bilirlik Alzheimer ve Frajil X Sendromu (FXS) gibi Parkinson hastalığı (AH ve PH) yanı sıra otizm spektrum bozukluğu (ASD) dahil olmak üzere birçok tanınmış entelektüel açıkları kendini gösterir. Ikinci hastalığı tek için düzenleyici protein, FMRP (Kırılgan X mental retardasyon Protein) 1-4 kaybına bağlı olan bir çok protein, geniş bir misexpression ile karakterize edilir. Nokta mutasyonları zihinsel engelli olan hastalarda tespit değil iken 5 kapatma mRNA değiştirerek mRNA stabilitesini ve çeviri yönetir Ayrıca, Değişken ücret etkileyen kromozomal yeniden düzenlenmeler bağlantılı x protein A (VCXA), bir protein, son zamanlarda, entelektüel açıkları ile ilişkilendirilmiştir şimdi olduğu gibi 6, 7, gözlenen ruhsal bozuklukları değişmiş VCXA ifadesi ve hedef prote düzensiz ifadesi kaynaklanan düşündürenins. Bu bulgulara, de novo ASD ile ilişkili genlerin kopya sayısı varyasyonları, böylece yüksek veya azalmış protein ekspresyon düzeyleri neden olabileceğini fikrini desteklemektedir, yeni gen duplikasyonlar ve silmeler ASD 8 için önemli bir risk faktörü olduğunun tespit edip araştıran bir çalışma doğrultusunda entelektüel açıkları.
Dikkate değer olarak, son araştırmalar başka bir proteinin ifade seviyesi, tam hemen hiçbir güvenlik marjları 9 yüksek protein miktarlarının bir sonucu olarak, toplanmayı önlemek için ayarlanır ilişkin kanıtlar sağlamıştır. Nedenle, daha küçük artışlarla, AD ve PD 9 gibi hastalıkları indüklemek için yeterli olduğu önerilmiştir. Protein ekspresyon kontrol katkıda moleküler makine çeşitliliği bu bulgular ışığında karmaşık bir düzenleme planı desteklemesine rağmen, 5000'den fazla memeli genlerinden 10 ekspresyon seviyesini araştıran bir çalışma göstermiştirdoğa daha cimri düzeni tercih: Proteinlerin hücresel bolluğu ağırlıklı böylece RNA kullanılabilirlik yönetimi esas ince ayar protein ifadesini hizmet ettiğini gösteren, çeviri 10 seviyesinde düzenlenir gösterilmiştir.
ilgi proteinlerin dozunu incelenmesi (POI) bu nedenle sadece bir proteinin endojen fonksiyonlarının anlaşılmasında önemli değil, aynı zamanda birçok hastalığın araştırılması ve tedavilerin geliştirilmesine değil. Böylece, son on yıl POI dozajı işlemek için RNA girişimi kullanarak çeşitli stratejiler ilerleyişini gördük. RNA enterferans yaygın protein fonksiyonunu incelemek için kullanılır ve hatta kanser ya da göz hastalıkları tedavi etmek yanı sıra hastalarda 11-13 antiviral tedavileri sürdürmeye klinik çalışmalarda uygulanan olmasına rağmen, bazı zorluklar strateji imkansız hale olabilir ortaya çıkabilir. Örneğin, homoloji ile demonte tahrik tohum sırası compara olduğuble kısa, dolayısıyla teşvik dışı hedef etkileri. Yüksek verimli dizileri nadirdir ve zaman alıcı ve masraflı olabilir sağ dizisini tanımlayan, (14 gözden) seçenekler binlerce arasında bulunan gerekir, ancak o zamandan beri sonuçlar yine hayal kırıklığı olabilir.
Alternatif bir strateji doğrudan antikorlar tarafından POI hedef etmektir. Burada, hücresel protein durumunu azaltmak için (Aktif Motif tarafından imal edilmiş), protein taşıyıcı Chariot kullanımını göstermektedir ve üç boyutlu rekonstrüksiyon istihdam knock-down aşağıdaki protein fonksiyonunu incelemek için.
Chariot, kendisi 2.8 kDa peptidinin, aktif motifi memeli hücreleri 15 membranları boyunca Servisi peptidler, proteinler ve antikorlar için kullanılır. Chariot-POI kompleksleri, bunun üzerine hidrofobik etkileşimler, kullanan olmayan kovalent makromoleküler kompleksler oluşturarak İÇN ile peptid ilişkilendirir bir endosome-ind hücrelere içselleştirmiş olanependent şekilde. Önemli olarak, Chariot mekik proteinlerin hücre içi lokalizasyonu etkiler de sitotoksik etkilerini uygulamak için veya yük 15 biyolojik aktivitesini etkilediği de işaret etti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bir doz tahrik şekilde hücre işlevlerini kontrol protein sentezleme seviyeleri önemini incelemek için bir protokol mevcut. Açıklanan protokol, dolayısıyla hücresel seviyede protein fonksiyonunun ayrıntılı çalışmalar sağlayarak hipokampal nöronlar dahil olmak üzere çeşitli memeli hücre tipleri, protein ekspresyonunun bir ince ayar manipülasyon sağlar.
RNA interferans özel hedefleri aşağı regüle etmek için bilinen bir strateji temsil eder, ancak, dezavanta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
sunulan çalışma Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından finanse edilerek bölgelerinde desteklenmiştir / RD Kanada ortaklık programının Frajil X Araştırma Vakfı, RD, Üniversite Erlangen-Nürnberg Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung Jerome Lejeune Vakfı RD ve Deutsche Forschungsgemeinschaft gelen RD ve RE. Yazarlar pCMV5-FLAG vektör kullanılabilir hale getirmek için teknik hücre kültürü bakımı ile ilgili yardım yanı sıra Prof. Dr. M. Wegner için Ingrid Zenger'i teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, özellikle video çekimi de yararlı destek için Nadja Schroeder teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Chariot | Active Motif | 30025 | store at -20°C |
| Neurobasal medium | Life technologies | 21103-049 | warm up to 37°C before using |
| 1xB27 | Life technologies | 17504044 | store at -20°C |
| L-glutamine | Life technologies | 25030-149 | store at -20°C |
| Penicilline and Streptomycine | Life technologies | 15140-122 | store at -20°C |
| Imaris software | Bitplane | n.a. | expensive, but unmatched |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | n.a. |
Riferimenti
- Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T., Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. . Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 219-245 (2012).
- Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson’s disease: potential therapeutic targets?. Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
- Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer’s disease or simply overexpression of APP?. Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
- Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
- Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
- Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
- Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
- Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
- Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
- Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
- DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
- Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
- Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
- Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
- Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
- Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
- Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
- Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
- Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
- Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).
