La lattoferrina umana (hLF) è un componente del sistema immunitario. In questo studio, i saggi di immunofluorescenza sono stati utilizzati per dimostrare sia l'assorbimento epatocellulare di hLF che una riduzione qualitativa della replicazione del virus dell'epatite C dopo il trattamento con hLF.
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Articolo metodologico
Immunofluorescenza per Monitorare il Cellular assorbimento di Lattoferrina umana e la sua associata attività antivirale contro il virus dell'epatite C
In questo articolo
Sommario
Abstract
Immunofluorescenza è una tecnica di laboratorio comunemente usata per studiare molti aspetti della biologia. Esso è tipicamente usato per visualizzare la distribuzione e / o la localizzazione di una molecola bersaglio in cellule e tessuti. Immunofluorescenza basa sulla specificità degli anticorpi fluorescenti marcati contro loro antigeni corrispondenti all'interno di una cella. Entrambi gli approcci diretti e indiretti immunofluorescenza possono essere utilizzati che si basano sull'uso di anticorpi legati con un fluorocromo. Immunofluorescenza diretta è meno frequentemente utilizzato perché fornisce il segnale più bassa, comporta costi più elevati e meno flessibilità. Al contrario, immunofluorescenza indiretta è più comunemente utilizzato per la sua elevata sensibilità e fornisce un segnale amplificato da più di un anticorpo secondario può collegare a ciascun anticorpo primario. In questo manoscritto, sia epifluorescenza e microscopia confocale sono stati usati per monitorare l'internalizzazione di lattoferrina umana, una componente importante del sistema immunitariosistema, nelle cellule epatiche. Inoltre, abbiamo monitorato il potenziale inibitorio del HLF sulla replica intracellulare del virus dell'epatite C mediante immunofluorescenza. Entrambi i vantaggi e gli svantaggi associati a questi approcci sono discussi.
Introduzione
L'immunofluorescenza è una tecnica che utilizza un microscopio a fluorescenza per visualizzare la distribuzione e/o la localizzazione di una molecola bersaglio in un campione biologico. L'immunofluorescenza si basa sulla specificità degli anticorpi marcati con fluorescenza contro i loro antigeni corrispondenti all'interno di una cellula1. Viene tipicamente utilizzato su sezioni di tessuto e linee cellulari in coltura al fine di analizzare la distribuzione/localizzazione di varie molecole biologiche come proteine, acidi nucleici e glicani. Va notato che l'immunofluorescenza è spesso utilizzata in combinazione con altri metodi non anticorpali di colorazione f....
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Protocollo
1. Le celle di preparazione e trattamento
- In una piastra a 24 pozzetti, mettere una copertura in vetro sul fondo dei pozzetti. Lavare ogni pozzetto con tampone fosfato (PBS).
- Seme Huh-7 cellule di supporto HCV replicone subgenomico in ciascun pozzetto ad una densità di 5 × 10 4 cellule / pozzetto. Se non esiste alcun trattamento per fare, le cellule possono essere seminate ad una densità maggiore. Il terreno di coltura è Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, 1 mM sodio piruvato e 250 mg / ml G-418 (per mantenere la replicone).
- Incubare a 37 ° C e 5% CO 2....
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Risultati
La capacità del epatica linea cellulare Huh-7 di internalizzare esogena amministrato HLF è stata monitorata mediante immunofluorescenza su una miscroscope confocale. HLF è stato aggiunto al mezzo di coltura e l'internalizzazione stato consentito per 24 ore, dopo di che, extracellulare HLF è stato lavato con PBS e membrana residuo legato HLF stato degradato con un 5 min trattamento tripsina (1 ml). Le cellule sono state reseeded e ha permesso di ri-aderire per 18 ore prima di immunofluorescenza. Al fine di delineare .......
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Discussione
L'epidemia HCV rimane una minaccia globale, con l'80% dei pazienti contagiati in via di sviluppo una infezione cronica, mettendoli a rischio di cirrosi, insufficienza epatica o epatocarcinoma. Azione diretta agenti antivirali mirati replicazione di HCV e la maturazione rappresentano agenti anti-HCV primi, come recentemente dimostrato dalla approvazione di regolamentazione di due inibitori della proteasi NS3 N-terminale (boceprevir e telaprevir). L'attività anti-HCV HLF è attualmente crede di comportarsi come.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato sia dagli Istituti Canadesi di Ricerca Sanitaria e Scienze Naturali che dal Consiglio di Ricerca Ingegneristica del Canada. M. Bisaillon è un Chercheur Boursier Senior del Fonds de Recherche en Santé du Québec e anche un membro del Centre de Recherche Clinique du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Ringraziamo il Dr. Ralf Bartenschlager per il generoso dono del sistema di repliconi HCV. Ringraziamo anche il Dr. Charles Rice e il Dr. Daniel Lamarre per aver gentilmente fornito la linea cellulare epatica. Vogliamo anche ringraziare Guillaume Tremblay per l'assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Solido infiammabile, irritante per la pelle, polmoni e occhi |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Senza Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-marcato anti-topo | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-marcato anti-coniglio | Invitrogeb | A21069 | |
| Germe di grano agglutinina Alexa Fluor 488 coniugato (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potenzialmente mutageno |
| Anti-NS5A coniglio | Abcam | ab2594 | |
| Topo anti-hLF | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst macchia | Life Techn. | H1399 | Potenzialmente mutageno e cancerogeno |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse microscopio visibile/epifluorescenza | Nikon | TE2000-E | |
| microscopio epifluorescenza/confocale | Olympus | FV1000 |
Riferimenti
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Derm. 133 (1), e4(2013).
- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative foo....
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Ristampe e permessi
