La lattoferrina umana (hLF) è un componente del sistema immunitario. In questo studio, i saggi di immunofluorescenza sono stati utilizzati per dimostrare sia l'assorbimento epatocellulare di hLF che una riduzione qualitativa della replicazione del virus dell'epatite C dopo il trattamento con hLF.
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Articolo metodologico
Immunofluorescenza per Monitorare il Cellular assorbimento di Lattoferrina umana e la sua associata attività antivirale contro il virus dell'epatite C
In questo articolo
Sommario
Abstract
Immunofluorescenza è una tecnica di laboratorio comunemente usata per studiare molti aspetti della biologia. Esso è tipicamente usato per visualizzare la distribuzione e / o la localizzazione di una molecola bersaglio in cellule e tessuti. Immunofluorescenza basa sulla specificità degli anticorpi fluorescenti marcati contro loro antigeni corrispondenti all'interno di una cella. Entrambi gli approcci diretti e indiretti immunofluorescenza possono essere utilizzati che si basano sull'uso di anticorpi legati con un fluorocromo. Immunofluorescenza diretta è meno frequentemente utilizzato perché fornisce il segnale più bassa, comporta costi più elevati e meno flessibilità. Al contrario, immunofluorescenza indiretta è più comunemente utilizzato per la sua elevata sensibilità e fornisce un segnale amplificato da più di un anticorpo secondario può collegare a ciascun anticorpo primario. In questo manoscritto, sia epifluorescenza e microscopia confocale sono stati usati per monitorare l'internalizzazione di lattoferrina umana, una componente importante del sistema immunitariosistema, nelle cellule epatiche. Inoltre, abbiamo monitorato il potenziale inibitorio del HLF sulla replica intracellulare del virus dell'epatite C mediante immunofluorescenza. Entrambi i vantaggi e gli svantaggi associati a questi approcci sono discussi.
Introduzione
L'immunofluorescenza è una tecnica che utilizza un microscopio a fluorescenza per visualizzare la distribuzione e/o la localizzazione di una molecola bersaglio in un campione biologico. L'immunofluorescenza si basa sulla specificità degli anticorpi marcati con fluorescenza contro i loro antigeni corrispondenti all'interno di una cellula1. Viene tipicamente utilizzato su sezioni di tessuto e linee cellulari in coltura al fine di analizzare la distribuzione/localizzazione di varie molecole biologiche come proteine, acidi nucleici e glicani. Va notato che l'immunofluorescenza è spesso utilizzata in combinazione con altri metodi non anticorpali di colorazione fluorescente, come le colorazioni 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) che sono tipicamente utilizzate per marcare il DNA2. Inoltre, questa tecnica prevede la fissazione delle cellule che consente l'analisi delle cellule in un momento specifico.
Diversi tipi di microscopi possono essere utilizzati per analizzare campioni di immunofluorescenza. Il più semplice è il microscopio a epifluorescenza (Figura 1) per il quale l'eccitazione del fluorocromo e la rilevazione della fluorescenza vengono effettuate attraverso lo stesso percorso luminoso3. Poiché la maggior parte della luce di eccitazione viene trasmessa attraverso il campione, solo la luce eccitatoria riflessa può raggiungere l'obiettivo insieme alla luce emessa. Questo approccio purtroppo porta a un frequente elevato rapporto segnale/rumore. Al contrario, la microscopia confocale (Figura 2) offre un netto vantaggio per aumentare la risoluzione ottica e il contrasto mediante l'aggiunta di un foro stenopeico spaziale posizionato sul piano confocale della lente per eliminare la luce sfocata4. Questo approccio consente la ricostruzione di strutture tridimensionali a partire dalle immagini ottenute. Tuttavia, poiché una frazione importante della luce del campione è bloccata nel foro stenopeico, sono spesso necessarie lunghe esposizioni.
Ci sono due classi di tecniche di immunofluorescenza, primaria (o diretta) e secondaria (o indiretta). L'immunofluorescenza diretta coinvolge un anticorpo primario legato a un fluorocromo (Figura 3). Questo metodo è utilizzato meno frequentemente perché fornisce un segnale inferiore, comporta costi più elevati e meno flessibilità1. Inoltre, tali anticorpi sono generalmente più difficili da trovare in commercio. D'altra parte, l'attacco diretto del fluorocromo all'anticorpo riduce significativamente il numero di passaggi della procedura, risparmiando tempo e riducendo frequentemente il segnale di fondo non specifico. Ciò limita anche la possibilità di reattività crociata degli anticorpi.
L'immunofluorescenza indiretta coinvolge un anticorpo primario non marcato che è specifico per l'epitopo di interesse1. Un anticorpo secondario che trasporta il fluorocromo riconosce quindi l'anticorpo primario e si lega ad esso (Figura 3). Sebbene l'immunofluorescenza indiretta sia più complessa e richieda più tempo rispetto all'immunofluorescenza diretta, viene spesso utilizzata a causa della sua elevata sensibilità e fornisce anche un segnale amplificato poiché più di un anticorpo secondario può legarsi a ciascun anticorpo primario. Inoltre, è disponibile una vasta gamma di anticorpi secondari commerciali a prezzi accessibili.
Il virus dell'epatite C (HCV) è un grave problema di salute pubblica con 130-170 milioni di individui cronicamente infetti in tutto il mondo. Al fine di fermare l'epidemia, la terapia contro l'HCV dovrà essere efficace e ampiamente disponibile. Gli studi incentrati su un prodotto naturale sicuro ed economico attivo contro l'HCV hanno rivelato l'attività antivirale della proteina lattoferrina umana (hLF) che lega e neutralizza il virione circolante5. Nel presente studio, l'indagine sull'attività di hLF sul sistema subgenomico dei repliconi dell'HCV, che è indipendente dall'ingresso e dalla diffusione virale, ha rivelato una distinta attività antireplicativa di hLF contro l'HCV. Questo manoscritto presenta uno studio in cui sono stati eseguiti saggi di immunofluorescenza per monitorare l'internalizzazione di hLF, un componente importante del sistema immunitario6, nelle cellule epatiche. Inoltre, abbiamo monitorato il potenziale inibitorio dell'hLF sulla replicazione intracellulare del virus dell'epatite C (HCV).
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Protocollo
1. Le celle di preparazione e trattamento
- In una piastra a 24 pozzetti, mettere una copertura in vetro sul fondo dei pozzetti. Lavare ogni pozzetto con tampone fosfato (PBS).
- Seme Huh-7 cellule di supporto HCV replicone subgenomico in ciascun pozzetto ad una densità di 5 × 10 4 cellule / pozzetto. Se non esiste alcun trattamento per fare, le cellule possono essere seminate ad una densità maggiore. Il terreno di coltura è Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, 1 mM sodio piruvato e 250 mg / ml G-418 (per mantenere la replicone).
- Incubare a 37 ° C e 5% CO 2. Il giorno dopo, trattare le cellule con 3 mM di HLF purificata da latte umano.
2. Paraformaldeide / saccarosio Preparazione (12% PAF e il 12% di saccarosio)
- Mettere 500 ml di PBS in un becher e riscaldarla tra 20 ° C e 30 ° C. Sciogliere 60 g di saccarosio in PBS. Sciogliere 60 g di paraformaldeide (PAF) nel / soluzione di saccarosio PBS. Aggiungere lentamente NaOH 2N (3 a 7 ml) fino a soluzione limpida ottenuta.
- Regolare il pH a 7,4 con HCl. Volume completa a 500 ml con PBS. Filtra per gravità su filtro Whatman. Prima dell'uso, diluire con PBS ad una concentrazione finale di 4% e il 4% PAF saccarosio (memoria 4 ° C per 1 settimana massimo).
3. immunofluorescenza
- Al tempo desiderato (0 ore, 2 ore o 24 ore di trattamento), lavare le cellule due volte (1 minuto) con PBS e fissare con PBS / 4% PAF / 4% di saccarosio per 20 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono tipicamente a 30-40% di confluenza e sono utilizzati 1,5x10 5 cellule.
- Permeabilize le cellule con 0,15% triton X-100 in PBS per 5 minuti a RT e blocco in siero normale di capra 10% (NGS) in PBS per 20 min.
- Diluire l'anticorpo primario della proteina di interesse in 10% NGS (esempio: principale del mouse anticorpo anti-HLF diluito 1: 1000). Applicare l'anticorpo primario alle cellule.
- Dopo 4 ore a temperatura ambiente o O /N a 4 ° C, lavare le cellule tre volte per 5 min a 10% NGS. Macchiare le cellule con anticorpo secondario marcato con fluorocromo diluito in 10% NGS (esempio: Fluorocromo con lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm legata ad un anticorpo anti-topo 1: 1.000) per 1 ora a RT al buio.
- Lavare le cellule una volta per 5 minuti con PBS e macchiare le cellule con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1 mg / ml) per 15 minuti a RT al buio.
- Lavare le cellule due volte per 5 minuti con PBS. Monte coprire occhiali sul mezzo di montaggio SlowFade prima visualizzazione tramite microscopia. Le cellule sono ora pronti per l'analisi da epifluorescenza o microscopia confocale.
- Utilizzare diversi controlli per assicurare la specificità del rilevamento. Ad esempio, tutti gli anticorpi possono essere omessi per rilevare autofluorescenza. L'anticorpo primario può essere omesso per determinare la colorazione non specifica da parte dell'anticorpo secondario. Infine, se possibile, controllare cellule o tessuti che non lo fannoesprimono la molecola di interesse può anche essere usato.
- Visualizzare i campioni utilizzando appropriati microscopio a fluorescenza (epifluorescenza o confocale) e set di filtri appropriati per l'etichetta fluorescente usato. Le diapositive possono anche essere memorizzati in una scatola di diapositive a <-20 ° C per un esame successivo.
4. microscopia a fluorescenza
- Conservare i campioni al buio per evitare photobleaching. Accendere la sorgente di luce del microscopio scelta (epifluorescenza o confocale).
- Accendere il microscopio. Accendere la fotocamera per il microscopio. Mettere il vetrino sul microscopio per la visualizzazione. Aggiungere olio per immersione sul vetrino per aumentare l'apertura numerica della lente obiettivo.
- Selezionare i filtri appropriati. Regolare la messa a fuoco e l'obiettivo appropriato. Regolare le imposte, al fine di rilevare il fluorocromo appropriata ma evitare photobleaching. Mantenere luci ambientali per minimizzare sfondo chiaro quando guardando campione.
- Cambia °filtri e di visualizzare diversi fluorocromi (ad esempio DAPI e per una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm). Scatta foto con la fotocamera.
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Risultati
La capacità del epatica linea cellulare Huh-7 di internalizzare esogena amministrato HLF è stata monitorata mediante immunofluorescenza su una miscroscope confocale. HLF è stato aggiunto al mezzo di coltura e l'internalizzazione stato consentito per 24 ore, dopo di che, extracellulare HLF è stato lavato con PBS e membrana residuo legato HLF stato degradato con un 5 min trattamento tripsina (1 ml). Le cellule sono state reseeded e ha permesso di ri-aderire per 18 ore prima di immunofluorescenza. Al fine di delineare ...
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Discussione
L'epidemia HCV rimane una minaccia globale, con l'80% dei pazienti contagiati in via di sviluppo una infezione cronica, mettendoli a rischio di cirrosi, insufficienza epatica o epatocarcinoma. Azione diretta agenti antivirali mirati replicazione di HCV e la maturazione rappresentano agenti anti-HCV primi, come recentemente dimostrato dalla approvazione di regolamentazione di due inibitori della proteasi NS3 N-terminale (boceprevir e telaprevir). L'attività anti-HCV HLF è attualmente crede di comportarsi come...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato sia dagli Istituti Canadesi di Ricerca Sanitaria e Scienze Naturali che dal Consiglio di Ricerca Ingegneristica del Canada. M. Bisaillon è un Chercheur Boursier Senior del Fonds de Recherche en Santé du Québec e anche un membro del Centre de Recherche Clinique du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Ringraziamo il Dr. Ralf Bartenschlager per il generoso dono del sistema di repliconi HCV. Ringraziamo anche il Dr. Charles Rice e il Dr. Daniel Lamarre per aver gentilmente fornito la linea cellulare epatica. Vogliamo anche ringraziare Guillaume Tremblay per l'assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| PAF | BioShop | PAR070.1 | Solido infiammabile, irritante per la pelle, polmoni e occhi |
| PBS | Wisent | 311-425-CL | Senza Ca2+ & Mg2+ |
| NGS | Wisent | 053-150 | |
| AlexaFluor 488-marcato anti-topo | Invitrogen | A11017 | |
| AlexaFluor 568-marcato anti-coniglio | Invitrogeb | A21069 | |
| Germe di grano agglutinina Alexa Fluor 488 coniugato (WGA) | Invitrogen | W11261 | Potenzialmente mutageno |
| Anti-NS5A coniglio | Abcam | ab2594 | |
| Topo anti-hLF | Abcam | ab10110 | |
| SlowFade | Invitrogen | S36937 | |
| Hoechst macchia | Life Techn. | H1399 | Potenzialmente mutageno e cancerogeno |
| hLF | Sigma | L0520 | |
| Nikon Eclipse microscopio visibile/epifluorescenza | Nikon | TE2000-E | |
| microscopio epifluorescenza/confocale | Olympus | FV1000 |
Riferimenti
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Derm. 133 (1), e4(2013).
- Portugal, J., Waring, M. J. Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study. Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).
- Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin. Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).
- Wakabayashi, H., Oda, H., Yamauchi, K., Abe, F. Lactoferrin for prevention of common viral infections. J Inf Chem. 20 (11), 666-671 (2014).
- Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein. Antiviral research. 111, 13-22 (2014).
- Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy. J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Green Remington, S. J. fluorescent protein: a perspective. Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).
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Ristampe e permessi
