We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.
Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called “concentric” ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.
Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1.
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10.
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.
Жидкость-носитель на основе ион-селективные электроды были успешно использованы в течение многих десятилетий, и для многих ионов, весьма специфические датчики доступны 22-26. При использовании в межклеточное пространство (ECS) позвоночных препаратов головного мозга, нужно иметь в виду, однако, что это довольно агрессивная техника: в то время как ширина ECS только вокруг 20-50 нм, диаметр ионселективного микроэлектродов составляет около 1 мкм (двуствольное электроды) или больше (концентрические электроды). Кончики ионоселективных микроэлектродов, таким образом, не только повредить ткани во время их сажание на кол ткани, но также увеличить ECS, в пользу недооценка ионных переходных процессов. Несмотря на эти подводные камни, внеклеточные ионные переходные процессы в ответ на активность нейронов удивительно согласуется между различными лабораториями 7,8, что свидетельствует о надежности этого метода.
Производительность и пригодность ионоселективных электродовзависит от их чувствительности и селективности, который определен в коктейль датчика ("жидкая мембрана ионофором ') используется. Датчик коктейли содержат специальный молекулу-носитель, например валиномицин для K + селективные микроэлектродов, который проявляет высокую селективность для калия 27. Тем не менее, перекрестная реактивность с другими ионами может происходить и должны быть проверены. Валиномицина проявляет значительную перекрестную реактивность на аммоний, который должен быть рассмотрен при интерпретации результатов (например, 11,12). Кроме того, так как напряжение-ответ из ионофоров следует Нернста поведение (ср уравнение 1), отношение сигнал-шум и порог обнаружения зависит от концентрации иона должна быть измерена. Таким образом, в то время как маленький [К +] о переходных вызывают большие изменения напряжения против низкого исходного уровня [К +] о, мала [Na +,] о переходные являются гораздо более трудно обнаружить против приветGH базовый [Na +] O (ср фиг.5 и 6).
Производительность ионоселективных электродов также определяется временным разрешением, которое в значительной степени определяется его электрической постоянной времени. Последнее в основном определяется осевой сопротивление датчика, а также распределенной емкостью по длине пипетки, между своими внутренними решений и внешней среды. В конфигурации двуствольного, сопротивление высоко, из-за большого колонке засыпаны датчика ионов. Для данного изолирующего диэлектрика (в данном случае боросиликатного стекла), емкость регулируется толщины диэлектрика. В двуствольными электродов, диэлектрическая ширина составляет стеклянной стенкой пипетки. Как стекло разжижает близко к кончику, диэлектрическая ширина падает, и увеличивается емкость. Эти факторы в совокупности производят электроды с временем отклика, которые варьируются от нескольких сотен миллисекунд до несколькихсекунд, так как эти факторы различны.
Основным преимуществом концентрической конструкции является то, что как сопротивление осевым и емкость в ванну значительно уменьшилась. Концентрические пипеток шунты большинство сопротивления, засыпанной ионообменника, оставляя лишь остаток в последние несколько микрометров до кончика. Кроме того, заполнение решение в концентрической пипетки физически удалена от ванны, разделенные толщиной две стеклянные стены, что значительно снижает емкость. Как было показано ранее 10, комбинированный эффект снижения сопротивления и емкости является улучшение временного разрешения двух порядков. В случае концентрических Са2 + и рН микроэлектродов, 90% время отклика были минимальны 10-20 мс 10. Соответствующий преимущество концентрической конструкции является низкий уровень шума (ср рисунок 8). Благодаря значительно пониженным сопротивлением, переходные напряжения от любого Ambienт шум сведены к минимуму. Кроме того, выход из таких переходных происходит быстро, вследствие быстрого постоянной времени. Такие артефакты поэтому маленький и быстрый, и имеют менее разрушительное воздействие на физиологические записей (см рисунок 8).
Есть также недостатки концентрической техники. Во-первых, их сборка является более сложным, и отнимает много времени. Вторым недостатком является необходимость поместить отдельную опорную микроэлектрода с наконечником, влекущие за собой использование либо отдельного микроманипулятором или специализированной двойной манипулятора. Наконец, двуствольное микроэлектродов может быть продлен до тройной стволом дизайна, что позволяет обнаруживать двух разных видов ионных одновременно 28, который не возможно концентрических электродов.
Наиболее распространенные ловушки
Неэффективное силанизация.
Самый важный шаг, и главным препятствием в изготовлении каких-либо жидких-Sensили на основе ионселективный микроэлектрода процедура силанизация. Когда электроды не реагируют на изменения в определенной концентрации ионов, или ответить суб-Нернста ответ (то есть, хорошо менее 58 мВ на разнице десятикратном концентрации), плохое эффективность силанизации, как правило, причина. По нашему опыту, это может произойти, если влажность воздуха слишком высокая или слишком низкая, типичный условий в разгар лета, или зимой, соответственно. Если это возможно, чтобы некоторый контроль над влажностью комнатной, эти проблемы могут быть преодолены.
Сопротивление электродов слишком высока.
При необходимости сопротивление ионно-чувствительный баррель может быть уменьшено путем обработки кромок. Для этого, не подвергайте его наконечник к сильной струей абразива, взвешенных в воде в течение нескольких секунд. Это может привести к его крайнее положение наконечника сломать и снизить сопротивление на нужное значение.
Солевые мостики.
Сольмосты между ионом и справочных баррелей привести к плохо или никак-отвечая электродов и, таким образом, также в значительной степени путать их производительность в калибровке. Как уже упоминалось выше (см пункт 1.6.), Это в основном вопрос, когда двуствольное тета стекло выбрали, но это редкий случай, когда с помощью смещения, технику витой ствол, описанной здесь.
С легкостью изготовления в виду, оригинальный двуствольное дизайн Lux 29 часто могут быть использованы с выгодой. Этот метод использует предварительное заполнение ионных и справочных бочки с солевыми растворами, быстро воздействия силана раствора его всасывания и изгнания из кончика, после введением ионита, а также с помощью кончика (см 30,31) , Эти электроды могут быть изготовлены в примерно 10 мин, но их размер чаевых обычно 4 мкм или более, и они более склонны к сбою во время эксперимента. В отличие от этого, методы силанизация что подвержен воздействию силана пара и теплаING может производить электроды с меньшими советов, которые в последние дни, а иногда и недель.
Взятые вместе, есть несколько протоколов и подходов о том, как подготовить ионоселективных микроэлектродов. Здесь мы описали две основные процедуры для изготовления витых двуствольными а также концентрических микроэлектродов, которые хорошо и надежно работать в наших лабораториях, с общей скоростью успеха близка к 100%. Важно отметить, что эти методы могут быть перечислены в измерении других видов ионов, в том числе рН или кальция, а также будет применим к другим препаратам, чем мозг, в том числе заполненных жидкостью полостей или жидкостей в целом. Последнее, но не менее, ион-селективные микроэлектродов позволяют определить концентрации ионов внутри клетки. Из-за их относительно большого размера наконечника (~ 1 мкм), это, однако, возможно только в клетках с большим теле клетки, например такие, как найти в беспозвоночных препаратов 28,32.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить С. Родриго для экспертного технической помощи. Мы благодарим С. Кёлера (центр Advanced Imaging, Генрих Гейне университета Дюссельдорф) за помощь в производстве видео. Исследования в лаборатории автора финансируется Ассоциацией Немецкого научно-исследовательского (DFG: Ro 2327 / 8-1 на CRR), Генриха Гейне университета Дюссельдорфа (до NH) и Национальных Институтов Здоровья предоставить R01NS032123 (для МК).
Abrasive | MicroPolish | Buehler GmbH | Dissolved in A.dest |
Borosilicate-glass capillaries | 1405059 | Hilgenberg | Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC 150 F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the sensor of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC100-F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the reference of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-200TF-15 | Science Products | Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-120TF-10 | Science Products | Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm |
Digidata | 1322A | Axon Instruments | |
Electrometer amplifier with headstage | Custom-made | Rin = 10TΩ and Ibias=50fA-1pA (commercially available alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany) | |
Experimental chamber | Custom-made | Commercially available from e.g. Warner Instruments,USA; Scientifica, UK | |
Furnace | Heraeus | Must stay constant at 200°C | |
Hard sticky wax / dental wax | Deiberit 502 | Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH | |
Hot plate | Custom-made | Must stay constant at 40°C | |
Microelectrodes holder made of plexiglas | Custom-made | Double-barreled: o.d. capillaries 1.5 mm, concentric: o.d. capillaries 2 mm | |
Micromanipulator | Leitz | ||
Micromanipulator | MD4R | Leica | |
Stereo microscope | M205C | Leica | |
Objective | Plan 0.8xLWD | Leica | |
Pipette puller | Model PP-830 | Narishige | Concentric microelectrodes |
Pipette puller | Model P-97 | Sutter Instruments | Sensor of concentric microelectrodes |
Pneumatic drug ejection system | Picospritzter Type II | General Valve TM Corporation | |
Travel dovetail stage | DT 25/M | Thorlabs | |
Two-component glue | Araldite | Huntsman advanced materials GmbH | One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together |
Silverwire | 99.9% | Wieland Edelmetalle | |
Slicer / Vibratome | Microm HM 650 V | Thermo Scientific | |
Software | AxoScope 8.1 | Axon Instruments | |
Vertical puller | Type PE-2 | Narishige Scientific Instruments | With a revolvable chuck for double-barreled microelectrodes |
x/y translational stage | Custom-made | ||
Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide | Sigma aldrich | 14343 | Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic |
CNQX | Sigma aldrich | C-127 | AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma aldrich | D5879 | |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma aldrich | 440191 | CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin |
L-Aspartic acid | Sigma aldrich | A9256 | Activates NMDA and non-NMDA and EAATs |
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma aldrich | G1626 | Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R), mGluRs and EAATs |
Potassium ionophore I – cocktail B | Fluka | 60403 | Based on valinomycin; CAUTION toxic |
Sodium ionophore II – cocktail A | Fluka | 71178 | Based on ETH 157 |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic |
Water, ultra pure | Sigma aldrich | W3500 |