Metodo di studio palatale Fusion utilizzando Statico Cultura Organo

Summary

Gli studi di sviluppo palato sono motivate dalla incidenza di palatoschisi, un difetto di nascita che impone un onere sanitario enorme e può lasciare deturpazione duratura. Si dimostra qui una tecnica per scaffali cultura palatali che possono essere utilizzati per studiare diverse vie di segnalazione coinvolti nello sviluppo del palato e fusione.

Abstract

Labio-palatoschisi sono tra i più comuni di tutti i difetti di nascita. Le forme secondarie palato dagli scaffali mesenchimali coperti di epitelio che aderisce a formare la linea di giunzione linea mediana epiteliale (MES). Le teorie suggeriscono che le cellule MES seguono una epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), l'apoptosi e la migrazione, per un palato fuso ^1. Completa disintegrazione delle MES è la fase finale di essenziale palatale confluenza con circostante cellule mesenchimali. Forniamo un metodo per la cultura organo palato. Il protocollo sviluppato in vitro permette lo studio dei processi biologici e molecolari durante la fusione. Le applicazioni di questa tecnica sono numerosi, incluse le risposte di valutazione agli agenti chimici esogeni, effetti di fattori di regolazione e di crescita e proteine ​​specifiche. Cultura organo palatale ha una serie di vantaggi tra cui manipolazione a diversi stadi di sviluppo che non è possibile utilizzare in studi in vivo.

Introduction

Schisi oro-facciali sono i difetti di nascita cranio-facciali più predominanti. Inoltre, prendendo in considerazione tutti i possibili difetti cranio-facciali, questi sono i seconda anomalia nascita più comune nei neonati ^2. Labbro leporino si verificano in circa 1 ogni 700 nascite negli Stati Uniti (US) ogni anno, l'incidenza di palatoschisi è pari a 475 bambini nati con labbro leporino al mese o 15 bambini con crepacci al giorno ^3. Circa l'1% dei bambini nati in tutto il mondo ogni anno mostra una qualche forma di dismorfologia cranio-facciale.

Clefts del palato e il labbro bisogno di una procedura molto costosa e complicata, con implicazioni permanente per i pazienti che hanno questa anomalia. Il costo stimato per ogni paziente con schisi orale è di circa 100.000 $ ^4. Il trattamento di un paziente con labiopalatoschisi richiede un team di medici, tra cui cranio-facciali, chirurghi otorinolaringoiatri, genetisti, anestesisti,discorso in lingua patologi, nutrizionisti, ortodontisti, protesisti, psicologi, neurochirurghi, e oftalmologi.

Nel palatogenesis, il palato secondario si pone come escrescenze accoppiati, che inizialmente si sviluppano verticalmente e subiscono elevazione mensola palatale sopra il dorso della lingua. A seguito di elevazione, gli scaffali palatali appaiati crescono verso la linea mediana (a E14.5 -E15 nei topi e negli esseri umani settimana 9). L'epitelio bordo mediale (MEE), che copre la punta mensola aderisce formando la cucitura linea mediana epiteliale.

Segue la transizione epitelio mesenchimale e / o apoptosi consentire mesenchimali confluenza. Adesione di opporsi MEE è un evento essenziale la cui alterazione provoca palatoschisi. Tuttavia, solo pochi studi hanno esaminato l'adesione iniziale dei ripiani palatali ^5. Le forme palato duro di differenziazione delle cellule mesenchimali in osteoblasti. Lo sviluppo anormale del palato in grado di produrre cleft palati con o senza coinvolgimento del labbro.

Tecniche di coltura di organi palato erano stati utilizzati ampiamente per molti laboratori nel corso degli ultimi 30 anni ^6,7.

In questo protocollo si descrive in dettaglio un metodo di dissezione palatale e della cultura d'organo statica. Il vantaggio di una cultura organo immobile è che permette scaffali palatali di fondersi. Questa tecnica è stata utilizzata con successo nel nostro laboratorio per molti di fusione e di segnalazione esperimenti ^8,9. Tuttavia l'applicazione della tecnica è vasto e può essere utilizzato ogni volta che è richiesto sistema di coltura organo statico, compresa la valutazione della risposta agli agenti chimici esogeni, gli effetti dei fattori di crescita regolamentazioni di vari percorsi e proteine ​​specifiche.

Figura 1. Topo Palatogenesis. Stadi di sviluppo del palato topi. (BF) ele Scansionemicrografie CTRON (SEM) del palato secondario, a volte sviluppo rappresentative. Le frecce rosse indicano: la parte iniziale di palatale adesione e fusione. Frecce gialle: punto per lo spazio tra i palati primarie e secondarie che spariranno dopo la fusione (ristampato da Kaufman ¹¹ con il permesso di PLoS One).

Protocol

Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui l'approvazione preliminare da parte del Comitato Istituzionale cura degli animali e l'uso locale. 1. Preparazione di dissezione Strumenti e cultura dei media Prelavaggio tutti gli strumenti da utilizzare in dissezione con 3% di perossido di idrogeno e quindi in autoclave a 121 ° C per 20 min. Filtro mezzi BGJb con soluzione antib…

Representative Results

La tecnica può essere applicata a diversi tipi di experiments.The seguente studio è stato progettato per testare l'effetto teratogeno della nicotina in vitro su palatale fusione. Due ceppi di topi sono stati utilizzati per questo esperimento, CD1 e tessuti C57.Palatal stata trattata con concentrazioni di nicotina emisolfato 0,06 e 6 mm. È stato osservato che i modelli di fusione palatali e tempi erano differenti nei due ceppi diversi. Nei topi CD1, mensole palatale del gruppo di controllo hanno continuat…

Discussion

Il protocollo in questo articolo fornisce un metodo di dissezione scaffali palatali da embrioni al giorno embrionale 13.5. Ripiani palatali da embrioni di topo sono state coltivate in una coltura privo di siero in una atmosfera di 95% O _{2 5%} CO 2 a 37 ° C. Dissezione palatale di successo è criticamente dipendente da molteplici fattori ad ogni passo durante la procedura dal momento embrionali dei topi sacrificati al completamento della cultura. Uno dei fattori più importanti che influenzano palatale fusione…

Materials

 

BGJb	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100X
Petri dishes	VWR	25384-088	100x15mm
Center-well organ culture dish	Falcon	#353037	60×15 mm
Wire triangular grid	Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.
Polycarbonate filter	GE& Water and Process Technologies	K04BP04700	Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope	ZEISS  Stemi SR
Culture hood	NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps	Dumont Medical		#5
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14003-G	Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS500086	Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14127-G	Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula)	Hu-friedy		CM 2/4
Protector laboratory hood	Labconco
Incubator	Thermo Scientific		Farma
			Series11 water Jacket
			Co2 incubator
PBS	GIBCO	10010-023	1X
Fiber optic Light source	Fiber-light  Dolan-Jenner	PL-750
Embedding cassette	Statlab	EC301
Kim Wipes	VWR	470173-504