Metode for å studere Palatal Fusion bruker Static Organ Culture

Summary

Studier av ganen utvikling er motivert av forekomsten av ganespalte, en fødsel defekt som pålegger en enorm helsebelastning og kan forlate varig skjemmende. Vi viser her en teknikk for å kultur palatal hyller som kan brukes til å studere forskjellige signalbaner som er involvert i utvikling palatinal og fusjon.

Abstract

Leppe- og ganespalte er blant de vanligste av alle fødselsskader. De sekundære gane skjemaer fra mesenchymale hyller dekket med epitel som Ddatavernloven danne midtlinjen epitel søm (MES). De teorier antyder at MES celler følger en epitelial til mesenchymale overgang (EMT), apoptose og migrasjon, gjør en smeltet gane ^1. Fullstendig oppløsning av MES er sluttfasen av avgjørende palatinal sammenløpet med omkringliggende mesenchymale celler. Vi tilveiebringe en fremgangsmåte for gane organkultur. Den utviklede in vitro-protokollen tillater studiet av de biologiske og molekylære prosesser ved smelting. Programmene for denne teknikken er mange, inkludert evaluering av respons på eksogene kjemiske midler, effekter av regulatoriske og vekstfaktorer og spesifikke proteiner. Palatal organkultur har en rekke fordeler, inkludert manipulasjon på ulike stadier av utvikling som ikke er mulig ved hjelp av di vivo studier.

Introduction

Orofacial kløfter er de mest dominerende kraniofaciale misdannelser. Også tar i betraktning alle mulige kraniofaciale defekter, disse er den nest vanligste fødsel anomali hos nyfødte ^2. Ganespalter skje på ca 1 i hver 700 fødsler i hvert år i USA (US), er forekomsten av ganespalte lik 475 barn født med ganespalter per måned eller 15 barn med ganespalte per dag ^tre. Omtrent 1% av barn født rundt om i verden hvert år utstilling eller annen form for kraniofaciale dysmorphology.

Kløfter av ganen og leppen trenger et svært kostbart og komplisert prosedyre med livslang konsekvenser for pasienter som har dette avviket. De beregnede kostnadene for hver pasient med oral kløften er ca $ 100 000 ^4. Behandling av en pasient med leppe- og ganespalte krever et team av leger inkludert kraniofaciale kirurger, otolaryngologists, genetikere, anestesileger,tale-språk patologer, ernæringsfysiologer, kjeveortopeder, prosthodontists, psykologer, nevrokirurger, og øyeleger.

I palatogenesis, oppstår det sekundære ganen som parrede utvekster, som til å begynne vokser vertikalt, og gjennomgår palatinal hylle høyde over dorsum av tungen. Etter heving, sammenkoblede palatal hyllene vokse mot midtlinjen (på E14.5 -E15 hos mus og uke 9 hos mennesker). Den mediale kanten epitel (MEE) som dekker hyllen spissen fester danner midtlinjen epithelial søm.

Dette etterfølges av epithelial til mesenchymal overgang og / eller apoptose for å tillate mesenchymale konfluens. Vedheft av opposisjon MEE er en viktig begivenhet som endring fører ganespalte. Men bare noen få studier undersøkt den innledende vedheft av palatal hyller ^5. Den harde ganen former ved differensiering av mesenchymale celler i osteoblast. Unormal utvikling av ganen kan produsere cleft ganer med eller uten involvering av leppen.

Gane orgel kultur teknikker hadde blitt brukt mye i mange laboratorier i løpet av de siste 30 årene ^6,7.

I denne protokollen beskriver vi i detaljer en metode for palatal disseksjon og statisk organ kultur. Fordelen med en ubevegelig organ kultur er at det tillater palatal hyller til å smelte. Denne teknikken hadde blitt brukt med hell i vårt laboratorium for mange fusion og signale eksperimenter ^8,9. Men omfanget av teknikken er stort, og kan brukes når det statiske organ kultursystem er nødvendig, herunder evaluering av svarene på eksogene kjemiske midler, effekten av regulatoriske vekstfaktorer i forskjellige reaksjonsveier og spesifikke proteiner.

Figur 1. Mouse Palatogenesis. Utviklings stadier av mus ganen. (BF) Scanning electron mikrobilder (SEM) av den sekundære ganen på representative utviklingstider. Røde piler: viser den første delen av palatal vedheft og fusion. Gule piler: peker på plassen mellom de primære og sekundære ganer som vil forsvinne etter fusjon (gjengitt fra Kaufman ¹¹ med tillatelse fra PLoS ONE).

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet må utføres i samsvar med de retningslinjer og regler for bruk av virveldyr, inkludert forhåndsgodkjenning av den lokale Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Utarbeidelse av dissekere Instrumenter og Kultur Media Forvask alle instrumenter som skal anvendes i disseksjon med 3% hydrogenperoksyd og deretter autoklav ved 121 ° C i 20 min. Filter BGJb media med antibiotika og antimykotisk løsning ved hjelp av en 0,22 mikrometer pore størrelse fil…

Representative Results

Teknikken kan brukes til forskjellige typer experiments.The følgende studie ble designet for å teste teratogen effekt av nikotin in vitro på palatinal fusjon. To stammer av mus ble brukt for dette eksperiment, ble CD1 og C57.Palatal vev behandlet med 0,06 og 6 mM konsentrasjoner av nikotin hemisulfat. Det ble observert at palatal fusjons mønstre og timing var forskjellige i de to forskjellige stammer. I CD1 mus, palatal hyller fra kontrollgruppen fortsatte sammensmelting i tidsavhengig måte. Men i den beha…

Discussion

Protokollen i denne artikkelen gir en metode for å dissekere palatal hyller fra embryoer på embryonale dag 13.5. Palatal hyller fra museembryoer ble dyrket i et serumfritt kulturmedium i en atmosfære med 95% O _{2 5%} CO2 ved 37 ° C. Vellykket palatalt disseksjon er kritisk avhengig av flere faktorer ved hvert trinn under prosedyren fra den embryoniske tidspunktet for avlives musene til gjennomføring av kulturen. En av de viktigste faktorene som påvirker palatinal fusjon er den tid det tar å starte organk…

Materials

 

BGJb	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100X
Petri dishes	VWR	25384-088	100x15mm
Center-well organ culture dish	Falcon	#353037	60×15 mm
Wire triangular grid	Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.
Polycarbonate filter	GE& Water and Process Technologies	K04BP04700	Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope	ZEISS  Stemi SR
Culture hood	NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps	Dumont Medical		#5
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14003-G	Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS500086	Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14127-G	Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula)	Hu-friedy		CM 2/4
Protector laboratory hood	Labconco
Incubator	Thermo Scientific		Farma
			Series11 water Jacket
			Co2 incubator
PBS	GIBCO	10010-023	1X
Fiber optic Light source	Fiber-light  Dolan-Jenner	PL-750
Embedding cassette	Statlab	EC301
Kim Wipes	VWR	470173-504