Metod för att studera Palatal Fusion använder statiska orgel kultur

Summary

Studier av gommen utveckling motiveras av förekomsten av gomspalt, en missbildning som innebär en enorm hälsa börda och kan lämna bestående vanställdhet. Vi visar här en teknik att odla palatala hyllor som kan användas för att studera olika signalvägar som är involverade i palatal utveckling och fusion.

Abstract

Läpp och gommen är bland de vanligaste av alla fosterskador. De sekundära gom blanketter från mesenkymala hyllor täckt med epitel som vidhäftar att bilda mittlinjen epitel sömmen (MES). Teorierna tyder på att MES celler följer en epitelial till mesenkymala övergång (EMT), apoptos och migration, vilket gör en smält gommen ^1. Komplett sönderdelning av MES är den sista avgörande fasen av palatal sammanflödet med omgivande mesenkymala celler. Vi tillhandahåller en metod för gommen organodling. Den utvecklade in vitro-protokoll möjliggör studiet av de biologiska och molekylära processer under sammansmältning. De tillämpningar av denna teknik är många, bland annat utvärdera svar på exogena kemiska medel, effekter av reglerande och tillväxtfaktorer och specifika proteiner. Palatal organkultur har ett antal fördelar, inklusive hantering i olika utvecklingsstadier som inte är möjligt med di vivo-studier.

Introduction

Orofaciala klyftor är de mest dominerande kraniofaciala missbildningar. Dessutom tar i beaktande alla tänkbara kraniofaciala defekter, dessa är de näst vanligaste födelse anomali hos nyfödda ^2. Gomspalt förekommer vid ungefär 1 av 700 födslar i USA (US) varje år, är förekomsten av gomspalt lika med 475 barn som föds med gomspalt per månad eller 15 barn med klyftor per ^dag 3. Cirka 1% av barn födda runt om i världen varje år uppvisar någon form av kraniofaciala dysmorfologi.

Klyftor av gommen och läppen behöver en mycket dyr och komplicerad procedur med livslångt konsekvenser för patienter som har denna anomali. Den beräknade kostnaden för varje patient med oral kluven är ungefär $ 100.000 ^4. Behandlingen av en patient med läpp- och gomspalt kräver ett team av läkare, inklusive kraniofaciala kirurger, otolaryngologer, genetiker, narkosläkare,tal språk patologer, dietister, ortodontister, protetiker, psykologer, neurokirurger och ögonläkare.

I palatogenesis uppkommer sekundära gommen såsom parade utväxter, som initialt växer vertikalt och genomgår palatal hylla höjd ovanför dorsum av tungan. Efter höjd, de parade palatala hyllorna växer mot mittlinjen (vid E14.5 -E15 hos möss och vecka 9 hos människa). Den mediala kant epitel (ANM) som täcker hyllan spetsen fastnar bildar mittlinjen epitel sömmen.

Detta följs av epitelial till mesenkymala övergång och / eller apoptos att tillåta mesenkymala sammanflödet. Adhesion av motsätta ANM är en viktig händelse vars förändring orsakar gomspalt. Men bara få studier undersökt initiala vidhäftningen av palatala hyllor ^5. De hårda gom former genom differentiering av mesenkymala celler till osteoblaster. Onormal utveckling av gommen kan producera klavt smaklökar med eller utan inblandning av läppen.

Palate organodlingstekniker hade använts i stor utsträckning för många laboratorier under de senaste 30 åren ^6,7.

I detta protokoll beskriver vi i detalj en metod för palatinal dissekering och statisk organkultur. Fördelen med en orörlig organkultur är att det tillåter palatinala hyllor att smälta. Denna teknik har använts med framgång i vårt laboratorium för många fusion och signaleringsexperiment ^8,9. Men omfattningen av tekniken är omfattande och kan användas när statiskt organodlingssystemet krävs, inklusive utvärdering av svar på exogena kemiska medel, effekterna av regel tillväxtfaktorer i olika vägar och specifika proteiner.

Figur 1. Mouse Palatogenesis. Utvecklingsstadier hos mössen gommen. (BF) Scanning electron mikrofotografier (SEM) av den sekundära gommen vid representativa utvecklings gånger. Röda pilarna: visa den första delen av palatal vidhäftning och fusion. Gula pilar: peka på utrymmet mellan de primära och sekundära gommar som kommer att försvinna efter fusion (omtryckt från Kaufman ¹¹ med tillstånd från PLoS One).

Protocol

Alla förfaranden som beskrivs måste utföras i enlighet med de riktlinjer och regler för användningen av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande från den lokala Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Framställning av dissekera Instrument och Odlingsmedia Förtvätt alla instrument som skall användas i dissekering med 3% väteperoxid och sedan autoklav vid 121 ° C under 20 minuter. Filter BGJb media med antibiotika och antimykotika lösningen med en …

Representative Results

Tekniken kan användas för olika typer av experiments.The följande studie var utformad för att testa den teratogena effekten av nikotin in vitro på palatal fusion. Två stammar av möss användes för detta experiment, var CD1 och C57.Palatal vävnad som behandlats med 0,06 och 6 mM koncentrationer av nikotin hemisulfat. Det konstaterades att palatala fusions mönster och timing var olika i de två olika stammar. I CD 1-möss, palatinala hyllor från kontrollgruppen fortsatte fusion i tidsberoende sätt. Me…

Discussion

Protokollet i denna artikel ger en metod för att dissekera palatala hyllor från embryon på embryonala dag 13,5. Palatal hyllor från musembryon odlades i ett serumfritt odlingsmedium i en atmosfär av _95% O2 5% _CO2 vid 37 ° C. Framgångsrik palatal dissektion är kritiskt beroende på flera faktorer vid varje steg under förfarandet från embryonala tiden för euthanized mössen för fullbordandet av kulturen. En av de viktigaste faktorerna som påverkar palatal fusion är den tid det tar att s…

Materials

 

BGJb	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100X
Petri dishes	VWR	25384-088	100x15mm
Center-well organ culture dish	Falcon	#353037	60×15 mm
Wire triangular grid	Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.
Polycarbonate filter	GE& Water and Process Technologies	K04BP04700	Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope	ZEISS  Stemi SR
Culture hood	NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps	Dumont Medical		#5
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14003-G	Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS500086	Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14127-G	Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula)	Hu-friedy		CM 2/4
Protector laboratory hood	Labconco
Incubator	Thermo Scientific		Farma
			Series11 water Jacket
			Co2 incubator
PBS	GIBCO	10010-023	1X
Fiber optic Light source	Fiber-light  Dolan-Jenner	PL-750
Embedding cassette	Statlab	EC301
Kim Wipes	VWR	470173-504