Metode til at studere Palatal Fusion hjælp Statisk Organ Culture

Summary

Undersøgelser af ganen udvikling er motiveret af forekomsten af ​​ganespalte, en misdannelse, der pålægger en enorm sundhed byrde og kan forlade varig vansiring. Vi demonstrerer her en teknik til kultur palatinalt hylder, som kan bruges til at studere forskellige signalveje der er involveret i udvikling og palatal fusion.

Abstract

Læbe-ganespalte er blandt de mest almindelige af alle fosterskader. De sekundære ganen formularer fra mesenkymale hylder dækket med epitel, der klæber til at danne midterlinjen epitelial sømmen (MES). Teorierne tyder på, at MES celler følge en epitelial til mesenkymale overgang (EMT), apoptose og migration, hvilket gør en sammensmeltet ganen ^1. Fuldstændig opløsning af MES er den sidste væsentlige fase af palatal sammenløb med omgivende mesenkymale celler. Vi tilvejebringe en fremgangsmåde til ganen organkultur. Den udviklede in vitro protokol tillader undersøgelse af de biologiske og molekylære processer i fusion. Anvendelserne af denne teknik er talrige, herunder evaluere svar på exogene, kemiske stoffer, virkningerne af regulerings- og vækstfaktorer og specifikke proteiner. Palatal organkultur har en række fordele, herunder manipulation på forskellige udviklingsstadier dette ikke er muligt ved hjælp af di vivo-undersøgelser.

Introduction

Orofaciale kløfter er de mest fremherskende kraniofaciale fosterskader. Også, idet der i hensyn til alle mulige kraniofaciale defekter, disse er den næsthyppigste fødsel anomali hos nyfødte ^2. Kløft ganer forekomme på cirka 1 ud af hver 700 fødsler i USA (US) hvert år, forekomsten af ganespalte er lig med 475 børn født med kløvede ganer om måneden eller 15 børn med kløfter per ^dag 3. Ca. 1% af børn født rundt om i verden hvert år udviser en form for kraniofacial dysmorfologi.

Kløfter af ganen og læben har brug for et meget dyrt og kompliceret procedure med livslang konsekvenser for patienter, der har denne anomali. De anslåede omkostninger for hver patient med oral kløft er ca $ 100,000 ^4. Behandlingen af ​​en patient med læbe-ganespalte kræver et team af læger, herunder kraniofaciale kirurger, otolaryngologists, genetikere, narkoselæger,tale-sprog patologer, ernæringseksperter, odontologer, prosthodontists, psykologer, neurokirurger og øjenlæger.

I palatogenesis, opstår den sekundære ganen som parrede udvækster, der oprindeligt vokser lodret og undergår palatal hylde højde over tungens dorsum. Efter elevation, de parrede palatinalt hylderne vokser mod midterlinjen (ved E14.5 -E15 i mus og uge 9 i mennesker). Den mediale kant epitel (MEE), som dækker hylden spids klæber danner midterlinjen epithelial søm.

Dette efterfølges af epitelial til mesenkymale overgang og / eller apoptose at tillade mesenchymale konfluens. Vedhæftning af modsatrettede MEE er en vigtig begivenhed, hvis ændring forårsager ganespalte. Men kun få studier undersøgt den indledende vedhæftning af palatinalt hylder ^5. Den hårde gane former af differentiering af mesenchymale celler i osteoblast. Den unormal udvikling af ganen kan producere nøglet ganer med eller uden inddragelse af læben.

Ganen orgel kultur teknikker havde været anvendt bredt til mange laboratorier i de seneste 30 år ^6,7.

I denne protokol vi beskriver i detaljer en metode til palatal dissektion og statisk orgel kultur. Fordelen ved en ubevægelig organkultur er at det giver palatinalt hylder til at fusionere. Denne teknik er blevet anvendt med succes i vores laboratorium for mange fusion og signaler eksperimenter ^8,9. Men omfanget af teknikken er enorme og kan bruges, når statisk orgel kultur-systemet er påkrævet, herunder evaluering af reaktioner på eksogene kemiske stoffer, virkningerne af regulatoriske vækstfaktorer i forskellige veje og specifikke proteiner.

Figur 1. Mus Palatogenesis. Udviklingsmæssige stadier af mus ganen. (BF) Scanning electron mikrografer (SEM) af den sekundære ganen på repræsentative udviklingsmæssige gange. Røde pile: viser den første del af palatal vedhæftning og fusion. Gule pile: punkt til rummet mellem de primære og sekundære ganer, som vil forsvinde efter fusion (genoptrykt fra Kaufman ¹¹ med tilladelse fra PLoS ONE).

Protocol

Alle beskrevne procedurer skal udføres i overensstemmelse med de retningslinjer og regler for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse af den lokale Institutional Animal Care og brug Udvalg. 1. Fremstilling af Dissecting Instrumenter og Kultur Medier Forvask alle instrumenter, der skal anvendes i dissektion med 3% hydrogenperoxid og derefter autoklave ved 121 ° C i 20 minutter. Filter BGJb medier med antibiotikum og antimykotisk løsning ved hjælp af en 0,22 um por…

Representative Results

Teknikken kan anvendes til forskellige former for experiments.The følgende undersøgelse blev designet til at teste den teratogene virkning af nikotin in vitro på palatal fusion. To stammer af mus blev anvendt til dette eksperiment blev CD1 og C57.Palatal væv behandlet med 0,06 og 6 mM koncentrationer af nikotin hemisulfat. Det blev observeret, at palatinalt fusion mønstre og timing var forskellige i de to forskellige stammer. I CD1 mus, palatinalt hylder fra kontrolgruppen fortsatte fusion i tidsafhængig …

Discussion

Protokollen i denne artikel giver en metode til at dissekere palatinalt hylder fra embryoner på embryonale dag 13.5. Palatal hylder fra musefostre blev dyrket i et serumfrit dyrkningsmedier i en atmosfære af 95% O _{2 5% CO2} ved 37 ° C. Vellykket palatal dissektion er kritisk afhængig af flere faktorer på hvert trin i proceduren fra embryonale tidspunktet for aflivet mus til færdiggørelsen af ​​kulturen. En af de vigtigste faktorer, der påvirker palatal fusion er den tid, det tager at starte orgel k…

Materials

 

BGJb	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	Lonza Inc.	17-602E	100X
Petri dishes	VWR	25384-088	100x15mm
Center-well organ culture dish	Falcon	#353037	60×15 mm
Wire triangular grid	Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.
Polycarbonate filter	GE& Water and Process Technologies	K04BP04700	Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope	ZEISS  Stemi SR
Culture hood	NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps	Dumont Medical		#5
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14003-G	Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS500086	Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades
Microdissecting scissors	Kent Scientific Corporation	INS14127-G	Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula)	Hu-friedy		CM 2/4
Protector laboratory hood	Labconco
Incubator	Thermo Scientific		Farma
			Series11 water Jacket
			Co2 incubator
PBS	GIBCO	10010-023	1X
Fiber optic Light source	Fiber-light  Dolan-Jenner	PL-750
Embedding cassette	Statlab	EC301
Kim Wipes	VWR	470173-504