一次多発性骨髄腫細胞の薬剤感受性の特徴付けのための器官のハイスループットシステム
Summary
We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.
Abstract
本研究では、患者由来の多発性骨髄腫（MM）細胞の化学感受性と不均一性を推定するためにex vivoでの薬剤感受性アッセイおよびデジタル画像解析を組み合わせた新規な方法を説明します。このアプローチは、patient-新たに細胞外マトリックス（コラーゲンまたは基底膜マトリックス）及び間質（含む各骨髄微小環境の再構成からなる、マルチウエルプレートに実装マイクロ流体チャンバに骨髄吸引物から抽出された一次MM細胞を播種することからなります由来間葉系幹細胞）またはヒト由来の内皮細胞（HUVEC）。チャンバは、異なる薬剤および濃度で薬漬けされており、デジタルカメラを搭載した電動式顕微鏡において、明視野顕微鏡を介して96時間連続して撮像されます。デジタル画像解析ソフトウェアは、膜の動きの存在下または非存在下で生細胞と死細胞を検出し、関数Oと生存率の変化の曲線を生成しますF薬物濃度および曝露時間。私たちは、各薬剤に対する腫瘍集団の化学感受性のパラメータだけでなく、腫瘍の不均一性の尺度として存在する亜集団の数を決定する計算モデルを使用しています。これらの患者に合わせたモデルは、その後、治療計画をシミュレートし、臨床応答を推定するために使用することができます。
Introduction
この方法の目的は、生理学的条件にできるだけ近くに、これらの結果は、化学療法抵抗性のサブを識別するために使用できる十分な精度で、ex vivoでの薬剤のパネルに、多発性骨髄腫（MM）初代細胞の薬剤感受性を特徴付けることです腫瘍負荷と、内集団は最終的に、臨床応答を推定するために設計された計算モデルをパラメータ化します。
計算モデルは、癌ホスト治療相互作用のような複雑なシステムを分析するための強力なツールです。しかし、モデルのみ、それらをパラメータ化するために使用されるデータと同じくらい良いです。それらはしばしば相互に排他的な実験条件で得られるように残念なことに、文献において利用可能なほとんどのデータは、そのようなモデルをパラメータ化するために、その現在の形で使用することができません。このように、新しい実験が頻繁に必要な実験パラメータのセットを取得することを目標に必要とされます。ほとんどの生存性アッセイは、しかしながら、破壊的と目されています我々は、時間点の数が少ない、しばしばのみに限定されるもの。このような実験は、システムの時間的動態に関する情報を提供することができないので、これは非常に、計算モデルをパラメータ化するために化学感受性アッセイの使用をハンディキャップ。これは多くの場合、このように利用可能な実験条件の数を制限し、サンプル当たり数百万人に限定されるものではなく、生検後の短い寿命を持っている一次癌細胞と特にそうです。また、ほとんどの生存性アッセイは、さらに細胞を摂動し、実行することができる実験の数を制限し、プロトコルに余分な作業を追加して定量化、時の非癌（間質）細胞から癌の分離を必要と。
40年前、サーモンと共同研究者1は、腫瘍細胞の化学感受性を評価するためのインビトロのコロニー形成アッセイにおけるそれらの有名なを提案しました。残念ながら、このアッセイは、による複数のMYE少数の混合成功を収めて対照条件下でコロニーを形成することができたロマ（MM）患者サンプル：これは、多発性骨髄腫幹細胞2と呼ばれている、MM細胞の0.1％に、0.001％のわずかな部分群を複製することができたことが推定されました。これは、かなりのアッセイの成功率、さらにより最近のモデル3に、一度に試験することができる薬物の数を制限しました。 （標準または実験）MM剤は四十年以上前に多数ある場合、この問題は今はるかに重要です。
これらの初期のアッセイの主な制限は、それらの二分出力されます。患者が特定の薬物を「感受性」または「抵抗性」のいずれかです。いいえ情報は、腫瘍集団の感度および不均一性の程度に関して提供されていません。このように、急成長している耐性細胞の小さな亜集団の患者は、治療に「敏感」に分類されますが、すぐに再発だろう、そのためではないベン治療からefit。癌患者4,5の全生存期間（OS）での応答の持続時間の重要性を考えると、それはこれらのアッセイが適切に一貫してOSを推定することができませんでしたか明らかです。
注文これらの制限を回避するために、および薬物のパネルにパーソナライズ臨床応答を推定することになる患者固有の計算モデルを生成することができるように、我々は、多発性骨髄腫（MM）細胞株の非破壊検査の薬剤感受性のための方法を開発しました細胞外マトリックスおよび間質6を含む骨髄微小環境のex vivo再構築、および一次MM細胞。このアッセイは、しかし、その寸法は、コスト機器の所定枚で一度に実行することができる実験や薬の数を制限し、特定の商用マイクロ流体スライド、に頼るの制限がありました。
ここに記載されているシステムは、高にこのオリジナル検定を拡張します器官用量応答プラットフォーム-throughput、非破壊細胞生存度を定量するために、デジタル画像解析アルゴリズムに基づいて、薬物のインビトロスクリーニングのため。 384ウェルまたは1536ウェルプレートの各プライマリMM細胞、細胞外マトリックス、および患者由来の間質及び成長因子を含む、骨髄微小環境の3次元再構成です。ライブ顕微鏡とデジタル画像解析は、用量反応面を生成するために使用される、異なる薬剤濃度での細胞死のイベントを検出するために使用されます。 インビトロデータから、数学的モデルは、（患者の腫瘍負荷内のサブ集団の大きさと化学感受性を識別し、腫瘍が臨床レジメン6に生理的条件下で薬剤（単数または複数）に応答する方法をシミュレートするために使用することができ図1）。
このプラットフォームの主な革新は次の通りである：（a）癌細胞の数が少ない、必要な（薬物コンセントあたり1,000〜10,000配給）; （b）は、生理学的条件（細胞外マトリクス、ストローマ、患者由来の成長因子）における薬効の評価を、 （c）の生存性マーカー7から無毒性のみ明視野画像を用いているため、このように蛍光8または生物発光9を用いて細胞をトランスフェクトする必要がありません。 （d）は、連続撮影は、濃度および暴露時間（薬力学）の関数としての薬剤の効果を提供します。および（e） インビトロと計算進化のモデル間の統合は、臨床転帰6（シルバら、準備中）を推定します。
間質細胞から癌を識別するためにデジタル画像解析アルゴリズムを可能にする重要な要因は、ウェルの底にそれらの異なる親和性である：MM細胞が付着し、マトリックス中に懸濁状態で残っていない、間質細胞は、底部に付着している間よく、その後ストレッチ。
この分離はあっても、MMおよび間質Aかかわらず、これが発生します同時に播種し、インキュベーションのO / Nプロセスの間に発生する再。プレートの遠心分離器でスピンダウンし、次の播種は、さらに、このプロセスを加速します。間質が低いプロファイルと暗い影（ 図2）を維持しながら、結果として、MM細胞は、暗いリングに囲まれた円形の明るいディスクなどの画像に表示されます。アルゴリズムの調整は、このようなサイズおよび形状のような他の形態学的特徴に基づいて、独立した癌および間質に行うことができるが、このように、現在の形式でのアッセイは、非接着性癌細胞に最も適しています。このプロトコルでは、（骨髄由来の間葉系幹細胞）BMSCとHUVECS、骨髄の間質および血管周囲のニッチを代表して、細胞外マトリックス（コラーゲンと基底膜マトリックス）の2種類だけでなく、共培養の2つのタイプを記述します、それぞれ。
、薬剤ごとに5つの濃度と2つの複製を384ウェルプレートを使用して、我々はTESすることができました一人の患者のサンプルと31種類の薬までトン。 補足図1は 、ロボットピペッターを使用して、最適な分布を表す1,536ウェルプレートでは、この数が、3は 、現在手動細胞播種のために使用されるレイアウトを示している図 127です。 図3の設計では、各384ウェルプレートは、21の薬剤を用いて試験し、7つの異なる薬物、または一人の患者の試料で3患者サンプルを運ぶことができます。各薬剤は、5つの濃度で表され、各条件をデュプリケートで播種されます。 4対照ウェル（薬剤を添加していないが）7薬（例えば、ウェル36〜39、126-129および200〜203）の各セットのために播種します。使用される薬物の効力を保証するために、ヒト骨髄腫細胞株（ 例えば、H929ま たはMM1.S）がシードされ、そして（ウェル76から89）に使用される薬物のそれぞれの最高濃度でデュプリケートで薬漬け。陽性細胞株のコントロールは、それらの用量応答曲線が同程度の交流であるため、使用される薬剤は、十分な効力を有することを保証しますロス実験。 2つのウェルは、（ウェル75及び90）は、撮像時のベンチトップインキュベータで可能性のある問題を検出すること、言い換えれば、環境条件の制御などの骨髄腫細胞株を播種します。ウェルの列挙は、取得時間を低減し、装置の摩耗を減少させ、顕微鏡の電動ステージによって移動距離を減少させるために、ジグザグのパターンに従います。
Protocol
Representative Results
Discussion
要約すると、これは、骨髄の再構成において、一次MM細胞と薬剤のex vivoでの薬力学の化学的感受性を定量化するための強力かつ高スループットの方法です。このプロトコル内の重要なステップは、ウェルの適切な播種され、適切な（予期される結果については、図2を参照）フォーカス：MMと間質細胞が均一に分布されていることを確認し、その間質細胞は、ウェルの底に?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、フロリダのBankhead-コーリーチームサイエンスグラント（2BT03）、健康/米国国立癌研究所（1R21CA164322-01）とモフィットがんセンターのチームサイエンスグラントの国立研究所の状態によって資金を供給されました。この作品は、H·リー·モフィットがんセンター＆研究所、NCI指定の総合がんセンター（P30-CA076292）でのトランスレーショナルリサーチコア施設によって部分的にサポートされています。初代細胞へのアクセスは、モフィットがんセンターで合計がん医療プロトコルを介して可能になりました。
Materials
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1mg/mL Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
Riferimenti
- Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
- Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
- Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
- Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
- Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
- Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
- Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236 (2012).
