نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية
Summary
We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.
Abstract
في هذا العمل وصفنا نهج الرواية التي تجمع بين خارج الجسم الحي المقايسات حساسية العقاقير وتحليل الصور الرقمية لتقدير chemosensitivity وتجانس المايلوما المتعددة (MM) الخلايا المشتقة من المريض. هذا النهج يتمثل في بذر خلايا MM الأولية المستخرجة حديثا من شفاطات نخاع العظم في غرف ميكروفلويديك تنفيذها في لوحات متعددة جيدا، يتألف كل منها من إعادة بناء المكروية نخاع العظم، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين أو الغشاء القاعدي المصفوفة) وسدى (patient- الخلايا المشتقة الجذعية الوسيطة) أو الخلايا البطانية المستمدة البشرية (HUVECs). يتم تخديره غرف مع وكلاء وتركيزات مختلفة، ويتم تصوير متتالي لمدة 96 ساعة من خلال مشرق المجهري الميدان، في المجهر الآلية مزودة بكاميرا رقمية. الرقمي صورة برامج التحليل بالكشف عن الخلايا الحية والميتة من وجود أو عدم وجود حركة الغشاء، ويولد منحنيات التغير في جدوى بوصفها وظيفة سو تركيز الدواء ومدة التعرض. نستخدم النموذج الحسابي لتحديد معالم chemosensitivity من السكان الورم إلى كل دواء، فضلا عن عدد من السكان الفرعي الحالي كمقياس للورم عدم التجانس. ويمكن بعد هذه النماذج مصممة خصيصا المريض استخدامها لمحاكاة الأنظمة العلاجية وتقدير الاستجابة السريرية.
Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو أن تميز حساسية العقاقير من المايلوما المتعددة (MM) الخلايا الأولية إلى لجنة من وكلاء خارج الحي، في أقرب وقت ممكن إلى الظروف الفسيولوجية، وبدقة كافية أن هذه النتائج يمكن استخدامها لتحديد chemoresistant الفرعية السكان داخل عبء الورم و، في نهاية المطاف، إلى بالحدود نماذج حسابية تهدف إلى تقدير استجابة سريرية.
النماذج الحسابية هي أدوات قوية لتحليل النظم المعقدة، مثل التفاعلات السرطان في استضافة العلاج. ومع ذلك، ليست سوى نماذج جيدة مثل البيانات المستخدمة لبالحدود لهم. لسوء الحظ، فإن معظم البيانات المتاحة في الأدب لا يمكن استخدامها في شكلها الحالي لبالحدود مثل هذه النماذج، لأنها غالبا ما يتم الحصول عليها في ظروف تجريبية يستبعد بعضها بعضا. وهكذا، غالبا ما يطلب من التجارب الجديدة وذلك بهدف الحصول على مجموعة من المعلمات التجريبية الحاجة. معظم فحوصات جدوى، ومع ذلك، هي مدمرة واللنا تقتصر على عدد قليل من النقاط الزمنية، في كثير من الأحيان واحدة فقط. هذا يعيق كثيرا من استخدام المقايسات chemosensitivity إلى بالحدود النماذج الحسابية، لأن مثل هذه التجارب تفشل في توفير معلومات عن ديناميات الزمنية للنظام. هذا ينطبق بشكل خاص مع الخلايا السرطانية الأولية، والتي غالبا ما تقتصر على بضعة ملايين في العينة، ولها عمر قصير بعد الخزعة، مما يحد من عدد من الظروف التجريبية المتاحة هذا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم فحوصات الجدوى تتطلب فصل من السرطان من غير السرطانية (سدى) الخلايا في وقت الكمي، وهو ما يضيف العمل الإضافي للبروتوكول، مما يشوش على الخلايا، ويحد من عدد من التجارب التي يمكن القيام بها .
قبل 40 عاما، سمك السلمون والمتعاونين 1 اقترح الشهيرة في المختبر تشكيل مستعمرة الفحص لتقييم chemosensitivity الخلايا السرطانية. للأسف وجدت هذا الاختبار متفاوتة من النجاح نظرا لقلة عدد MYE متعددةLOMA (MM) عينات المريض التي كانت قادرة على تشكيل مستعمرات تحت ظروف التحكم: وتشير التقديرات إلى أنه ليس هناك سوى مجموعة فرعية صغيرة من 0.001٪ إلى 0.1٪ من خلايا MM كانت قادرة على تكرارها، ويجري توصف بأنها خلايا الجذعية المايلوما المتعددة 2. هذه محدودة إلى حد كبير من نسبة نجاح الفحص وعدد من الأدوية التي يمكن اختبارها في وقت واحد، حتى في أكثر النماذج الأخيرة 3. هذه المسألة هي أكثر أهمية بكثير الآن عندما كلاء MM (معيار أو تجريبي) هم أكثر عددا مما كانت عليه قبل أربعة عقود.
وجود قيود كبير من هذه المقايسات المبكرة انتاجهم إنقسم: إما المريض "حساسة" أو "مقاومة" لدواء معين. يتم توفير أي معلومات بشأن درجة من الحساسية وعدم تجانس السكان الورم. وبالتالي، سيتم تصنيف المرضى الذين يعانون من جماعات فرعية صغيرة من الخلايا المقاومة سريعة النمو بأنها "حساسة" للعلاج، ولكن الانتكاس قريبا، وبالتالي لا بنefit من العلاج. ونظرا لأهمية مدة الاستجابة في البقاء على قيد الحياة (OS) من مرضى السرطان 4،5، فمن الواضح كيف كانت هذه المقايسات غير قادرة على تقدير OS صحيح على الدوام.
من أجل الالتفاف على هذه القيود، وتكون قادرة على توليد نماذج حسابية المريض محددة من شأنها أن تقدير استجابة سريرية شخصية إلى لجنة المخدرات، قمنا بتطوير طريقة لحساسية غير المدمر اختبار المخدرات من المايلوما المتعددة (MM) خطوط الخلايا والخلايا MM الأولية في إعادة الإعمار خارج الحي من نخاع العظام المكروية، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية وسدى 6. هذا الاختبار، ومع ذلك، كان الحد من الاعتماد على شريحة معينة ميكروفلويديك التجارية، أبعادها وتكلفة تقييد عدد من التجارب أو الأدوية التي يمكن أن يؤديها في وقت واحد في قطعة معينة من المعدات.
النظام هنا وصف يمتد هذا الاختبار الأصلي إلى أعلى-throughput عضوي النمط منصة الاستجابة للجرعة، لفي المختبر فحص المخدرات، استنادا إلى خوارزمية تحليل الصور الرقمية لغير المدمر تحديد بقاء الخلية. كل بئر في 384 أو 1536-جيدا لوحات هي إعادة الإعمار 3D من نخاع العظام المكروية، بما في ذلك الخلايا الأولية MM، المصفوفة خارج الخلية، وسدى ونمو العوامل المستمدة من المريض. يتم استخدام المجهر الحية وتحليل الصور الرقمية للكشف عن أحداث موت الخلايا في تركيزات المخدرات المختلفة، والتي تستخدم لتوليد السطوح الاستجابة للجرعة. من البيانات في المختبر، ويحدد نموذج رياضي حجم وchemosensitivity السكان فرعية ضمن عبء ورم المريض، ويمكن استخدامها لمحاكاة كيفية الورم سوف يستجيب للدواء (ق) في الظروف الفسيولوجية في نظام السريري 6 ( الشكل 1).
الابتكارات الرئيسية من هذه المنصة هي: (أ) عدد قليل من الخلايا السرطانية المطلوبة (1،000-10،000 في تناسق المخدراتالتموينية)؛ (ب) تقييم نجاعة الأدوية في الظروف الفسيولوجية (المصفوفة خارج الخلية، سدى، وعوامل النمو المشتق المريض)؛ يستخدم (ج) لا سمية من علامات الجدوى 7 منذ التصوير حقل مشرق فقط، وبالتالي لا حاجة ل transfect الخلايا مع مضان 8 أو 9 تلألؤ بيولوجي. (د) على التصوير المستمر تأثير المخدرات بوصفها وظيفة من التركيز ومدة التعرض (الدوائية)؛ و (ه) التكامل بين في المختبر ونماذج تطورية الحسابية، لتقدير نتائج سريرية 6 (سيلفا وآخرون، قيد الإعداد).
العامل الرئيسي الذي يسمح للخوارزمية تحليل الصور الرقمية لتبين السرطان من الخلايا اللحمية هو تقارب مختلف بهم إلى قاع البئر: خلايا MM لا تلتزم، ويبقى معلق في المصفوفة، في حين أن الخلايا اللحمية تلتزم الجزء السفلي من جيدا ثم تمتد.
يحدث هذا الفصل على الرغم من MM وسدى لإعادة المصنف في نفس الوقت، ويحدث أثناء O / N عملية الحضانة. يسرع البذر الغزل عليها في أجهزة الطرد المركزي التالي من لوحة مزيد من هذه العملية. ونتيجة لذلك، تظهر خلايا MM في الصورة كأقراص مشرق مستديرة تحيط بها حلقة مظلمة، في حين يحتفظ سدى عن الانظار وأغمق (الشكل 2). وهكذا، فإن فحص في شكله الحالي هو الانسب لخلايا السرطان غير ملتصقة، على الرغم من التعديلات في الخوارزمية يمكن القيام به لسرطان منفصل وسدى على أساس الخصائص الشكلية الأخرى، مثل الحجم والشكل. في هذا البروتوكول وصفنا نوعين من المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين والطابق السفلي مصفوفة الغشاء)، فضلا عن نوعين من المشترك الثقافات، مع (نخاع المستمدة الخلايا الجذعية الوسيطة العظام) BMSC وHUVECS، التي تمثل منافذ فراغي وحول الأوعية من نخاع العظام ، على التوالي.
باستخدام لوحة 384 جيدا، 5 تركيزات في المخدرات واثنين من مكررات، كنا قادرين على قسم التدريب والامتحاناتتي تصل إلى 31 الأدوية المختلفة مع عينة من مريض واحد. في لوحات 1536 جيدا هذا الرقم 127. الشكل 3 يصور تخطيط المستخدمة حاليا اليدوي للزرع الخلايا، في حين يمثل التكميلي الشكل 1 التوزيع الأمثل باستخدام pipettor الروبوتية. في التصميم من الشكل 3، يمكن لكل لوحة 384 جيدا تحمل 3 عينات المريض مع 7 الأدوية المختلفة، أو عينة واحدة المرضى اختبار مع 21 المخدرات. يتم تمثيل كل دواء بنسبة 5 تركيزات، والمصنف كل شرط في التكرارات. والمصنف 4 آبار المراقبة (مضاف المخدرات) لكل مجموعة من 7 المخدرات (على سبيل المثال، الآبار 36-39، 126-129 و200-203). لضمان فاعلية من الأدوية المستخدمة، خط خلية الورم النخاعي الإنسان (على سبيل المثال، H929 أو MM1.S) هو أيضا المصنف، وتخديره في التكرارات على أعلى تركيز كل من العقاقير المستخدمة (الآبار 76-89). مراقبة خط الخلية إيجابية يضمن أن العقاقير المستخدمة لديها قوة كافية، منذ منحنيات الاستجابة للجرعة هي المتردد مقارنةتجارب روس. هي المصنفة بئرين مع خط خلية الورم النقوي عن السيطرة للظروف البيئية، وبعبارة أخرى، للكشف عن المشاكل المحتملة في مقاعد البدلاء كبار حاضنة أثناء التصوير (الآبار 75 و 90). تعداد الآبار يتبع نمطا متعرج من أجل تقليل المسافة التي مرحلة الآلية المجهر، مما يقلل من اكتساب الوقت ويقلل من التآكل من المعدات المشمولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
باختصار، هذا هو وسيلة قوية وعالية الإنتاجية لتحديد chemosensitivity الخلايا MM الابتدائية وخارج الحي الدوائية للأدوية في إعادة بناء نخاع العظم. الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي بذر السليم للآبار وتركز كافية (انظر الشكل 2 للنتائج المتوقعة): تأكد من أن الخلاي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل دولة بانكهد-كولي الفريق العلمي منحة ولاية فلوريدا (2BT03)، والمعاهد الوطنية لل/ المعهد الوطني للسرطان الصحة (1R21CA164322-01) ومركز موفيت للسرطان علوم فريق غرانت. وقد تم دعم هذا العمل في جزء من مرفق بالحركة البحوث الأساسية في لي موفيت للسرطان ومعهد بحوث H.، وهو مركز السرطان الشامل NCI المعينة (P30-CA076292). تم الحصول على الخلايا الأولية ممكن من خلال بروتوكول رعاية مرضى السرطان إجمالي في مركز موفيت للسرطان.
Materials
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1mg/mL Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
Riferimenti
- Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
- Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
- Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
- Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
- Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
- Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
- Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236 (2012).
