一个器官高通量系统原发性多发性骨髓瘤细胞的药物敏感性的表征
Summary
We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.
Abstract
在这项工作中，我们描述了一种新的方法，结合了体外药物敏感性测定和数字图像分析以估计敏感性病人衍生的多发性骨髓瘤（MM）细胞的异质性。这种方法包括在接种初级MM细胞从骨髓抽吸新鲜萃取入在多孔板实施，各由一个重建骨髓微环境的微流体腔室，包括细胞外基质（胶原或基底膜基质）和基质（患者 – 间充质干细胞）或来源于人的内皮细胞（HUVECs）。该室被麻醉用不同剂和浓度，并依次为96小时，通过亮视野显微术成像，在电动显微镜配备有数码相机。数字图像分析软件检测从存在或不存在膜运动的活的和死的细胞，并产生变化的曲线中存活力作为函数O˚F药物浓度和暴露时间。我们使用的计算模型，以确定肿瘤人口每种药物的敏感性的参数，以及亚群表现为肿瘤的异质性的量度的数量。这些患者定制模型可以用于模拟治疗方案，并估计临床反应。
Introduction
该方法的目标是多发性骨髓瘤（MM）的药物敏感性初级细胞表征的试剂离体面板，尽可能接近生理条件，并且以足够的精度，这些结果可以被用于识别化疗耐药子在肿瘤负荷，并最终人口，参数化设计，估计临床反应的计算模型。
计算模型是有力工具分析复杂系统，如癌症宿主治疗的相互作用。然而，模型是仅作为数据用于参数它们作为良好。不幸的是，在文献中可获得大多数数据不能用在目前的形式来参数这样的模型，因为它们常常是在相互排斥的实验条件下获得的。因此，新的实验，通常需要以获得该组所需要的实验参数的目标。大多数存活测定，但是，是破坏性的，第我们限于少量的时间点，通常只有一个。这极大障碍敏感性测定法的使用来参数计算模型，因为这样的实验未能提供对系统的时间动态信息。这是原发性癌细胞，这往往限于少数百万每个样品，并有活检后很短的寿命，因此限制了可用的实验条件下的数量，尤其如此。此外，大多数存活测定需要来自非癌症（基质）细胞在量化，这将增加额外的工作来的协议时的癌症的分离，进一步扰乱细胞，并限制了可被执行的实验数。
40年前，鲑鱼和合作者1中提出其著名的体外集落形成试验对肿瘤细胞的化疗敏感性的评估。不幸的是这个实验发现混杂的成功是由于小数倍的MYE洛马（MM）的患者样本均能够形成对照条件下的菌落：据估计，只有一小亚组的0.001％至MM细胞的0.1％是能复制的，被称为多发性骨髓瘤干细胞2。这显著限于该测定的成功率，而且可以在同一时间进行测试的药物的数量，即使是在更近的模型3。这个问题更重要，现在，当MM剂（标准或实验）比四十年前更多了。
这些早期试验中的主要限制是其对分输出：要么患者是“敏感”或“抗性”，以一个特定的药物。没有任何信息是关于敏感性肿瘤人口和异质性程度。因此，患者的小亚群快速增长的抗性细胞将被归类为“敏感”，以治疗，但会复发不久，因而不奔从EFIT治疗。定响应的癌症患者4,5的总生存率（OS）的持续时间的重要性，显然这些测定如何不能够正确估计操作系统一致。
为了克服这些限制，并能够生成患者特异性的计算模型，将估计的个性化的临床反应的药物的一个面板上，我们已经开发出的多发性骨髓瘤（MM）细胞系，非破坏性测试药物敏感性的方法和初级MM细胞在离体重建骨髓微环境，包括细胞外基质和基质6。该测定中，然而，有依靠一个特定的商业微流体滑动，其尺寸和成本的限制，可以在一个给定的设备来进行一次实验或药物的数量的限制。
在此描述的系统扩展这种原始检测到高-throughput器官剂量-反应平台，用于在体外筛选药物，基于数字图像分析算法，以非破坏性地量化细胞活力。每个孔在384或1536孔板是3D重建骨髓微环境，其中包括初级MM细胞，细胞外基质，和患者来源基质和生长因子。在线显微镜和数字图像分析被用于检测在不同的药物浓度，其用于产生剂量反应表面的细胞死亡的事件。从体外数据，建立数学模型确定在患者的肿瘤负荷的大小和亚群的敏感性，并可以用来模拟如何肿瘤会响应在生理条件的药物（多个）在临床治疗方案6（ 图1）。
该平台的主要创新点有：（一）少数必需的癌细胞（1000-10000元药concent比）; （二）在生理条件下的药效（细胞外基质，基质，病人衍生的生长因子）的评估; （c）约生存能力标记7，因为只有亮场成像无毒性的情况下，因此，不需要转染细胞与荧光8或生物发光9; （四）连续成像提供药物的效果的浓度和暴露时间（药效学）的函数;和（e） 在体外和计算演化模型之间的整合，来估计临床结果6（Silva 等，准备中）。
允许所述数字图像分析算法来从基质细胞辨别癌症的关键因素是其不同的亲和力的井底：MM细胞不附着，并保持在悬浮液中的基质，而基质细胞粘附的底部好，再舒展。
这种分离发生，即使MM和基质一再接种在同一时间，并在孵化的O / N的过程发生。该板的在离心纺丝向下以下播种进一步加速了这一过程。其结果是，MM细胞出现在图像如由暗环围绕圆亮磁盘中，而基质保持低调和暗的阴影（ 图2）。因此，在目前形式的测定法是最适合于非粘附癌细胞，尽管该算法中调整可以基于其它形态学特征，例如大小和形状来完成，以独立的癌症和基质。在这个协议中，我们描述了两种类型的细胞外基质（胶原和基底膜基质），以及两种类型的共培养物，与（骨髓间充质干细胞）的BMSC和脐静脉内皮细胞，代表骨髓的间质和血管周围龛分别。
使用384孔板，5个浓度每药物和两次重复，我们能够TES牛逼多达31种不同的药物与单个患者的样本。在1536孔板这个数目是127。 图3示出了目前用于人工细胞接种的布局，而补充图1表示使用机器人移液器的最佳分配。在从图3的设计中，每个384孔板可以携带与7种不同的药物，或一个患者样品与21的药物测试3的患者样品。每种药物由5个浓度表示，并且每个条件被接种在重复。 4对照孔（无药物加）接种为每组7药物（如井36-39，126-129和200-203）。为了确保使用的药物的效力，人类骨髓瘤细胞系（ 例如，H929或MM1.S）也是播种，并且在每个使用的（孔76-89）的药物的最高浓度麻醉中重复。阳性细胞系控制可确保所使用的药物具有足够的效力，因为它们的剂量响应曲线具有可比性的交流罗斯的实验。两口井接种与骨髓瘤细胞系作为对照的环境条件，换言之，以检测在台式培养箱可能出现的问题在成像期间（井75和90）。孔的枚举如下之字形图案，以减少所涉及的显微镜的电动载物台，从而减少采集时间，并降低了设备的磨损的距离。
Protocol
Representative Results
Discussion
总之，这是一个强大的和高通量的方法来量化主要的MM细胞的药物体外药效学的敏感性在重建骨髓。这个协议中的关键步骤是该井的正确播种和适当聚焦（ 见图2预期的结果）：确保MM和基质细胞是均匀分布的，即基质细胞粘附到井的底部，即所有的MM细胞在同一焦平面，并且MM细胞具有明亮的圆盘由一个暗环所包围的部分。
在不适当的情况下，播种（ <strong…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该研究是由美国佛罗里达州的班克黑德 – 科莱科技团队格兰特（2BT03），健康/美国国家癌症研究所（1R21CA164322-01）和莫菲特癌症中心的团队科学格兰特全国学院的国家。这项工作已部分由转化研究核心设施的H. Lee Moffitt癌症中心和研究所，一个NCI指定的综合癌症中心（P30-CA076292）的支持。获得原代细胞成为可能通过总癌症护理协议在莫菲特癌症中心。
Materials
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1mg/mL Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
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