En Organotypiske High Throughput System til karakterisering af Drug følsomhed Primære myelomatoseceller

Summary

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Abstract

I dette arbejde beskriver vi en ny tilgang, der kombinerer ex vivo narkotika følsomhed assays og digital billedanalyse at estimere kemosensitivitet og heterogenitet patient-afledte myelomatose (MM) celler. Denne tilgang består i såning primære MM celler frisk udvundet knoglemarvsaspirater i mikrofluide kamre implementeret i flere brønde, der hver består af en rekonstruktion af knoglemarvens mikromiljø, herunder ekstracellulære matrix (kollagen eller basalmembran matrix) og stroma (patient- afledte mesenchymal-stamceller) eller human-afledte endotelceller (HUVEC'er). Kamrene er bedøvet med forskellige midler og koncentrationer, og afbildes sekventielt i 96 timer gennem lysfeltmikroskopi, i en motoriseret mikroskop udstyret med et digitalt kamera. Digital billedanalyse softwaren registrerer levende og døde celler fra tilstedeværelsen eller fraværet af membran bevægelse og frembringer kurver for ændringer i levedygtighed som funktion of lægemiddelkoncentration og eksponeringstid. Vi bruger en computermodel til at bestemme parametrene for kemosensitivitet af tumoren befolkningen hvert medikament, såvel som antallet af sub-populationer til stede som et mål for tumor heterogenitet. Disse patient skræddersyet modeller kan derefter anvendes til at simulere terapeutiske regimener og estimere kliniske respons.

Introduction

Målet med denne fremgangsmåde er at karakterisere lægemiddelfølsomhed af myelomatose (MM) primære celler til et panel af agenter ex vivo, så tæt som muligt på fysiologiske betingelser, og med tilstrækkelig præcision at disse resultater kan anvendes til at identificere kemoterapi sub- befolkninger i tumorbyrde og i sidste ende, at parametrisere beregningsmodeller designet til at estimere klinisk respons.

Beregningsmodeller er stærke værktøjer til at analysere komplekse systemer, såsom vekselvirkninger cancer-host-terapi. Men modeller er kun så god som de data, der anvendes til at parametrisere dem. Desværre kan de fleste data i litteraturen ikke anvendes i sin nuværende form til at parametrisere sådanne modeller, da de ofte er fremstillet i gensidigt udelukkende eksperimentelle betingelser. Således er nye eksperimenter ofte påkrævet med det mål at opnå sæt af eksperimentelle parametre, der er nødvendige. De fleste levedygtighed analyser, dog er destruktive og thos begrænset til et lille antal tidspunkter, ofte kun en. Dette i høj grad handicap brugen af ​​kemosensitivitet analyser til parametrisere beregningsmodeller, da sådanne forsøg ikke at give oplysninger om de tidsmæssige dynamik i systemet. Dette er især tilfældet med primære kræftceller, der ofte er begrænset til et par millioner pr prøve, og har en kort levetid efter biopsi, hvilket begrænser antallet af eksperimentelle betingelser til rådighed. Desuden fleste rentabilitet analyser kræver adskillelse af kræft fra de ikke-cancer (stroma) celler på tidspunktet for kvantificering, som tilføjer ekstra arbejde til protokollen, yderligere forstyrrer cellerne, og begrænser antallet af eksperimenter, der kan udføres .

40 år siden, laks og samarbejdspartnere ¹ foreslås deres berømte in vitro kolonidannelse assay til vurdering af kemosensitivitet af tumorceller. Desværre er dette assay fundet blandet succes på grund af det lille antal multiple myeLoma (MM) patientprøver som var i stand til at danne kolonier under kontrolbetingelser: Det blev anslået, at kun en lille undergruppe af 0,001% til 0,1% af MM-celler var i stand til replikation, at de kan betegnes som multipel myelom stamceller ^2. Dette væsentligt begrænset succesraten for analysen, og antallet af lægemidler, der kunne testes på én gang, selv i nyere modeller ^3. Dette spørgsmål er meget vigtigere nu, hvor MM agenter (standard eller eksperimentelle) er mere talrige end fire årtier siden.

En væsentlig begrænsning af disse tidlige assays er deres dikotomiseret udgang: enten en patient er "følsomme" eller "resistent" til et bestemt lægemiddel. Ingen oplysninger gives om graden af ​​følsomhed og heterogenitet af tumor befolkning. Således ville patienter med små sub-populationer af hurtigt voksende resistente celler klassificeres som "følsomme" til terapi, men ville tilbagefald kort tid, og derfor ikke benstemt ydelse fra behandling. Betragtning af betydningen af varigheden af respons i samlet overlevelse (OS) i kræftpatienter ^4,5, er det klart, hvordan disse analyser ikke var i stand til korrekt estimere OS konsekvent.

For at omgå disse begrænsninger, og for at kunne generere patientspecifikke beregningsmodeller, der ville estimere personlig klinisk respons på et panel af stoffer, har vi udviklet en metode til ikke-destruktivt test narkotika følsomhed af myelomatose (MM) cellelinjer og primære MM celler i en ex vivo rekonstruktion af knoglemarvens mikromiljø, herunder ekstracellulære matrix og stroma ^6. Denne analyse havde imidlertid begrænsningen for at stole på en bestemt kommerciel microfluidic dias, hvis dimensioner og omkostninger begrænset antallet af forsøg eller lægemidler, der kan udføres på én gang i en given stykke udstyr.

Den her beskrevne system udvider denne originale assay i en høj-throughput organotypisk dosis-respons-platform, til in vitro screening af lægemidler baseret på en digital billedanalyse algoritme til ikke-destruktivt kvantificere cellelevedygtighed. Hver brønd i 384 eller 1.536 brønde er en 3D-rekonstruktion af knoglemarvens mikromiljø, herunder primære MM celler, ekstracellulære matrix, og patient-afledt stroma og vækstfaktorer. Levende mikroskopi og digital billedanalyse anvendes til at opdage celledød begivenheder i forskellige lægemiddelkoncentrationer, som anvendes til at generere dosis-respons overflader. Fra in vitro-data, en matematisk model identificerer størrelsen og kemosensitivitet af subpopulationer i patientens tumorbyrde, og kan anvendes til at simulere hvordan tumoren ville reagere på lægemidlet (r) i fysiologiske betingelser i en klinisk regime ⁶ ( figur 1).

De vigtigste nyskabelser i denne platform er: (a) lille antal af kræftceller, der kræves (1.000-10.000 pr narkotika concentration); (B) vurdering af lægemiddel virkningsfuldhed i fysiologiske betingelser (ekstracellulær matrix, stroma, patient-vækstfaktorer); (C) Ingen toksicitet fra levedygtighed markører ⁷ da kun lyse felt billedbehandling bruges, derfor ingen grund til at transficere celler med fluorescens ⁸ eller bioluminescens ^9; (D) kontinuerlig billedbehandling giver stof effekt som funktion af koncentration og eksponeringstid (farmakodynamik); og (e) integration mellem in vitro og beregningsmæssige evolutionære modeller til at estimere kliniske resultat ⁶ (Silva et al., under forberedelse).

Den vigtigste faktor, der tillader den digitale billedanalyse algoritme til at skelne kræft fra stromale celler er deres forskellige affinitet til bunden af ​​brønden: MM celler klæber ikke og forbliver i suspension i matrixen, mens stromale celler klæber til bunden af godt og derefter strække.

Denne adskillelse sker selvom MM og stroma enre podet på samme tid, og forekommer under O / N-processen inkubation. Spinding ned i centrifugen efter podning af pladen yderligere fremskynder denne proces. Som følge heraf synes MM celler i billedet som runde lyse diske omgivet af en mørk ring, mens stroma opretholder en lav profil og en mørkere nuance (figur 2). Således assayet i sin nuværende form er bedst egnet til ikke-adhærente cancerceller, selv justeringer i algoritmen kunne gøres til separat kræft og stroma baseret på andre morfologiske træk, såsom størrelse og form. I denne protokol beskriver vi to typer ekstracellulære matrix (kollagen og basalmembranmatrix) samt to typer co-kulturer, med (knoglemarv afledte mesenchymal-stamceller) BMSC og HUVECS, repræsenterer de interstitielle og perivaskulære nicher af knoglemarven henholdsvis.

Ved hjælp af en 384-brønds plade, 5 koncentrationer pr narkotika og to gentagelser, kunne vi test op til 31 forskellige lægemidler med prøven af ​​en enkelt patient. I 1.536 brønde dette nummer er 127. Figur 3 viser layoutet for øjeblikket anvendes til manuel cellepodning, mens Supplemental Figur 1 viser den optimale fordeling ved hjælp af en robot pipette. I udformningen af figur 3, kan hver 384-brønds plade bære 3 patientprøver med 7 forskellige lægemidler, eller en patientprøve testet med 21 lægemidler. Hvert lægemiddel er repræsenteret ved 5 koncentrationer, og hver betingelse er podet i dubletter. 4 kontrolbrønde (ingen medikament tilsat) podes for hvert sæt 7 lægemidler (f.eks, brønde 36-39, 126-129 og 200-203). At sikre styrken af de lægemidler, der anvendes, en human myelomcellelinje (fx H929 eller MM1.S) også podet, og bedøvet i dubletter ved den højeste koncentration af hver af de lægemidler, der anvendes (brønde 76-89). Den positive cellelinie sikrer at de anvendte medikamenter har tilstrækkelig styrke, da deres dosisresponskurver er sammenlignelige across forsøg. To brønde podes med en myelomcellelinje som kontrol for de miljømæssige forhold, med andre ord, for at opdage eventuelle problemer i bordpladen inkubator under billedbehandling (brønde 75 og 90). Opregningen af ​​brøndene følger en zigzag-mønster for at reducere den afstand, det motoriserede trin i mikroskopet, hvilket reducerer erhvervelse tid og reducerer slid på udstyret.

Protocol

Anvendelse af menneskelige celler fra biopsier som beskrevet nedenfor blev godkendt af Moffitt s Institutional Review Board og udført under det kliniske forsøg MCC # 14745 udført på H. Lee Moffitt Cancer Center og Research Institute. 1. Sortering af MM Celler fra knoglemarvsaspirater Indsamle knoglemarvsaspirater (20 ml) fra patienter i natriumheparin sprøjte. Isolere mononukleære celler ved centrifugering fortyndet marv (1: 1 med sterilt PBS) over en sterilt vandi…

Representative Results

Strømmen af eksperimentet er kort beskrevet i figur 1 Hvis alle trin er fuldført, billederne opnået ved mikroskopet skal svare til figur 2:. Leve MM celler bør klart ses som lyse diske og BMSCs eller HUVEC'er bør være knap synlige og godt fordelt i baggrunden. Som det ses i figur 2A, MM celler varierer i størrelse fra den ene patient til den anden, men generelt er de mindre end cellelinier. Da de praktisk talt ikke replikere ex vivo under intervallet…

Discussion

Sammenfattende er dette er en kraftfuld og high throughput metode til at kvantificere kemosensitivitet af primære MM celler og ex vivo farmakodynamik lægemidler på en rekonstruktion af knoglemarven. De kritiske trin i denne protokol er korrekt podning af brøndene og passende fokusering (se figur 2 for forventede resultater): sikre, at MM og stromaceller ensartet fordelt, at stromale celler er adhærerende til bunden af brønden, at alle MM cellerne er i den samme fokale plan, og at MM celle…

Materials

EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1mg/mL Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system