Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

Summary

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Abstract

Dans ce travail, nous décrivons une nouvelle approche qui combine ex vivo tests de sensibilité aux médicaments et l'analyse d'image numérique pour estimer la chimiosensibilité et l'hétérogénéité de myélome multiple (MM) de cellules provenant de patients. Cette approche consiste à ensemencer les cellules MM primaires fraîchement extraites d'aspirats de moelle osseuse dans des chambres microfluidiques mises en œuvre dans des plaques à puits multiples, chacun consistant en une reconstruction du microenvironnement de la moelle osseuse, y compris la matrice extracellulaire (collagène ou de la membrane basale matrice) et le stroma (patient des cellules dérivées de souches mésenchymateuses ou des cellules endotheliales) d'origine humaine (HUVEC). Les chambres sont drogués avec différents agents et concentrations, et sont imagés séquentiellement pendant 96 heures grâce à la microscopie à champ clair, dans un microscope motorisé équipé d'un appareil photo numérique. Logiciel d'analyse d'image numérique détecte cellules vivantes et mortes de présence ou absence de mouvement de la membrane, et génère des courbes d'évolution de la viabilité en fonction of concentration de drogue et le temps d'exposition. On utilise un modèle de calcul pour déterminer les paramètres de la chimiosensibilité de la population ayant une tumeur de chaque médicament, ainsi que le nombre de sous-populations présentes en tant que mesure de l'hétérogénéité de la tumeur. Ces modèles adaptés au patient peuvent alors être utilisées pour simuler des régimes thérapeutiques et estimer la réponse clinique.

Introduction

Le but de cette méthode est de caractériser la sensibilité aux médicaments du myélome multiple (MM) des cellules primaires pour un panneau d'agents ex vivo, aussi près que possible des conditions physiologiques, et avec suffisamment de précision que ces résultats peuvent être utilisés pour identifier des sous-chimiorésistance populations au sein de la charge tumorale et, finalement, à paramétrer des modèles de calcul visant à estimer la réponse clinique.

Les modèles informatiques sont des outils puissants pour analyser les systèmes complexes, tels que le cancer interactions hôte-thérapie. Cependant, les modèles sont seulement aussi bon que les données utilisées pour les paramétrer. Malheureusement, la plupart des données disponibles dans la littérature ne peuvent pas être utilisés dans sa forme actuelle pour paramétrer ces modèles, car ils sont souvent obtenus dans des conditions expérimentales mutuellement exclusifs. Ainsi, de nouvelles expériences sont souvent nécessaires dans le but d'obtenir l'ensemble des paramètres expérimentaux nécessaires. La plupart des essais de viabilité, cependant, sont destructrices et enous limités à un petit nombre de points dans le temps, souvent un seul. Cette handicape grandement l'utilisation de tests de chimiosensibilité de paramétrer des modèles de calcul, puisque de telles expériences ne parviennent pas à fournir des informations sur la dynamique temporelle du système. Cela est particulièrement vrai avec les cellules cancéreuses primaires, qui sont souvent limitées à quelques millions par échantillon, et ont une courte durée de vie après la biopsie, limitant ainsi le nombre de conditions expérimentales disponibles. En outre, la plupart des essais de viabilité nécessitent la séparation du cancer des cellules non cancéreuses (stroma) au moment de la quantification, qui ajoute un surcroît de travail pour le protocole, perturbe en outre les cellules, et limite le nombre d'expériences qui peuvent être effectuées .

Il ya 40 ans, le saumon et ses collaborateurs ¹ proposé leur fameux test in vitro de la formation de colonies pour l'évaluation de la chimiosensibilité des cellules tumorales. Malheureusement, ce test a trouvé un succès mitigé en raison du petit nombre de mye multiplesLoma (MM) des échantillons de patients qui étaient capables de former des colonies dans des conditions de contrôle: Il a été estimé que seulement un petit sous-groupe de 0,001% à 0,1% des cellules MM ont été capables de replication, étant désignées comme des cellules souches de myélome multiple ^2. Cela a limité de manière significative le taux de succès de l'essai et le nombre de médicaments qui pourraient être testés en même temps, même dans les modèles plus récents ^3. Cette question est beaucoup plus important maintenant, quand des agents MM (standard ou expérimentales) sont plus nombreux que il ya quatre décennies.

Une limitation majeure de ces premiers essais est leur production dichotomique: soit un patient est «sensible» ou «résistant» à un médicament particulier. Aucune information n'a été fournie concernant le degré de sensibilité et de l'hétérogénéité de la population de la tumeur. Ainsi, les patients avec de petites sous-populations de cellules résistantes à croissance rapide seraient classées comme «sensibles» à la thérapie, mais retombait peu, et donc pas benEFIT du traitement. Compte tenu de l'importance de la durée de la réponse de la survie globale (OS) des patients atteints de cancer ^{de 4,5,} il est clair comment ces tests ne sont pas en mesure d'estimer correctement OS cohérente.

Afin de contourner ces limitations, et d'être en mesure de générer des modèles de calcul spécifiques à un patient qui permettraient d'estimer la réponse clinique personnalisé à un panel de médicaments, nous avons développé une méthode pour la sensibilité au médicament de contrôle non destructif de myélome multiple (MM) lignées cellulaires et les cellules MM primaires dans une ex vivo reconstruction du microenvironnement de la moelle osseuse, y compris le stroma et la matrice extracellulaire ^6. Cet essai, cependant, avait la limitation de compter sur une diapositive microfluidique commerciale particulière, dont les dimensions et le coût limité le nombre d'expériences ou de médicaments qui pourraient être réalisées à la fois dans un équipement donné.

Le système décrit ici étend cette analyse originale dans une haute-throughput organotypique plate-forme de dose-réponse, pour le criblage in vitro de médicaments, sur la base d'un algorithme numérique d'analyse d'image de manière non destructive quantifier la viabilité cellulaire. Chaque puits dans 384 ou 1 536 puits des plaques est une reconstruction 3D du microenvironnement de la moelle osseuse, y compris des cellules primaires de MM, une matrice extracellulaire, et le stroma et les facteurs de croissance dérivés de patients. Microscopie directe et une analyse d'image numérique sont utilisés pour détecter des événements de mort cellulaire dans différentes concentrations de médicament, qui sont utilisés pour générer des surfaces de dose-réponse. D'après les données in vitro, un modèle mathématique identifie la taille et la chimiosensibilité des sous-populations à l'intérieur de la charge tumorale du patient, et peut être utilisé pour simuler la manière dont la tumeur répondrait à la drogue (s) dans des conditions physiologiques dans un régime clinique ⁶ ( Figure 1).

Les principales innovations de cette plate-forme sont: (a) petit nombre de cellules cancéreuses nécessaires (1,000-10,000 par médicament concentration); (B) l'évaluation de l'efficacité des médicaments dans des conditions physiologiques (matrice extracellulaire, stroma, des facteurs de croissance provenant de patients); (C) Aucune toxicité de la viabilité des marqueurs ⁷ puisque seule l'imagerie du champ lumineux est utilisé, donc pas nécessaire de transfecter des cellules avec une fluorescence ⁸ ou ⁹ bioluminescence; (D) l'imagerie en continu fournit l'effet du médicament en fonction de la concentration et du temps d'exposition (pharmacodynamie); et (e) l'intégration entre les modèles in vitro et l'évolution de calcul pour estimer le résultat clinique ⁶ (Silva et al., en préparation).

Le facteur clé qui permet à l'algorithme d'analyse d'image numérique de discerner le cancer à partir de cellules stromales est leur affinité différente pour le fond du puits: les cellules MM ne se conforment pas, et restent en suspension dans la matrice, tandis que les cellules stromales adhèrent au fond de la bien et puis étirer.

Cette séparation se produit même si MM et le stroma unere ensemencées en même temps, et se produit au cours de la / O N processus d'incubation. L'ensemencement de filature dans la centrifugeuse suivante de la plaque accélère encore ce processus. En conséquence, les cellules MM apparaissent dans l'image que les disques ronds lumineux entouré par un anneau sombre, tandis que le stroma maintient un profil bas et une teinte plus foncée (Figure 2). Ainsi, le dosage dans sa forme actuelle est le mieux adapté pour les cellules cancéreuses non-adhérentes, bien que des ajustements dans l'algorithme pourrait être fait pour le cancer et le stroma séparé reposant sur d'autres caractéristiques morphologiques, comme la taille et la forme. Dans ce protocole, nous décrivons deux types de matrice extracellulaire (collagène et de sous-sol matrice de membrane) ainsi que les deux types de co-cultures, avec (cellules souches mésenchymateuses de moelle extraite d'os) BMSC et HUVEC, qui représente les créneaux interstitiels et périvasculaires de la moelle osseuse respectivement.

Utiliser une plaque de 384 puits, 5 concentrations par la drogue et deux répétitions, nous avons été en mesure de test jusqu'à 31 médicaments différents avec l'échantillon d'un seul patient. En 1536 plaques ainsi ce nombre est 127. Figure 3 représente la disposition actuellement utilisée pour l'ensemencement manuel cellulaire, tandis que la figure 1 supplémentaire représente la distribution optimale aide d'une pipette robotisée. Dans la conception de la figure 3, chaque plaque de 384 puits peut transporter 3 échantillons de patients avec 7 différents médicaments, soit un échantillon de patient testés avec 21 médicaments. Chaque médicament est représenté par 5 concentrations, et chaque état est ensemencée en double. 4 puits de contrôle (pas de médicament ajouté) sont ensemencées pour chaque ensemble de 7 médicaments (par exemple, les puits 36-39, 126-129 et 200-203). Pour garantir l'efficacité des médicaments utilisés, une lignée cellulaire de myélome humain (par exemple, H929 ou MM1.S) est également tête de série, et droguée en double à la plus forte concentration de chacun des médicaments utilisés (puits 76-89). Le contrôle de la lignée cellulaire positif assure que les médicaments utilisés ont une puissance suffisante, puisque leurs courbes de réponse de dose sont comparables acexpériences Ross. Deux puits sont ensemencés avec une lignée cellulaire de myélome que le contrôle des conditions environnementales, en d'autres termes, pour détecter d'éventuels problèmes dans la paillasse incubateur lors de l'imagerie (puits 75 et 90). Le dénombrement des puits suit un motif en zigzag afin de réduire la distance parcourue par la platine motorisée du microscope, ce qui réduit le temps d'acquisition et de réduire l'usure de l'équipement.

Protocol

L'utilisation de cellules humaines dérivées de biopsies, comme décrit ci-dessous a été approuvé par l'Institutional Review Board de Moffitt et effectuée en vertu de l'essai clinique de MCC # 14745 menée à l'H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute. 1. Tri des cellules de la moelle osseuse MM aspirats Récupérer des aspirats de moelle osseuse (20 ml) provenant de patients à l'héparine de sodium seringue. Isoler les cellules monon…

Representative Results

Le flux de l'expérience est brièvement décrit à la figure 1 Si toutes les étapes sont terminées avec succès, les images obtenues par le microscope devraient être équivalentes à la figure 2:. Vivent les cellules MM doivent être clairement visibles comme des disques lumineux et BMSCs ou HUVECs devraient être à peine visible et bien réparties dans le fond. Comme on le voit sur ​​la figure 2A, les cellules MM varient en taille d'un patient à l&#39…

Discussion

En résumé, ceci est une méthode de débit puissant et haute de quantifier chimiosensibilité des cellules de MM primaires et ex vivo pharmacodynamique de médicaments dans une reconstitution de la moelle osseuse. Les étapes critiques au sein de ce protocole sont le bon ensemencement des puits et en se concentrant adéquate (voir Figure 2 pour les résultats escomptés): veiller à ce que les cellules de MM et stromales sont uniformément réparties, que les cellules stromales sont adhérent…

Materials

EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1mg/mL Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system