מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים
Summary
We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.
Abstract
בעבודה זו אנו מתארים גישה חדשנית המשלבת לשעבר מבחני רגישות תרופת vivo וניתוח תמונה דיגיטלי להעריך chemosensitivity וההטרוגניות של מיאלומה נפוצה תאים (MM) המופק מחולה. גישה זו מורכבת בזריעת תאי MM עיקריים חילוץ טרי מaspirates מח עצם לתאי microfluidic מיושמים בצלחות רב גם, כל אחת בהיקף של בנייה מחדש של מייקרו-סביבת מח עצם, כולל מטריקס (Matrix קולגן או קרום במרתף) וסטרומה (פונות תאי גזע המופקים mesenchymal) או תאי האנדותל אדם נגזר (HUVECs). התאים מסוממים עם סוכנים וריכוזים שונים, והם צילמו ברצף במשך 96 שעות באמצעות מיקרוסקופ שדה הבהיר, במיקרוסקופ ממונע מצוידים במצלמה דיגיטלית. תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלית מזהה תאי חיים ומתים מנוכחות או עדר של תנועת קרום, ומייצרת עקומות של שינוי בכדאיות כo פונקציהF ריכוז תרופה וזמן חשיפה. אנו משתמשים במודל חישובים כדי לקבוע את הפרמטרים של chemosensitivity של אוכלוסיית גידול לכל תרופה, כמו גם את המספר של תת-אוכלוסיות הנוכחיות כמדד להטרוגניות גידול. מודלים מותאמי מטופל אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לדמות משטרי טיפול ולהעריך תגובה קלינית.
Introduction
מטרתה של שיטה זו היא לאפיין את רגישות התרופה של מיאלומה נפוצה (MM) תאים ראשוניים לפנל של סוכנים לשעבר vivo, קרוב ככל האפשר לתנאים פיסיולוגיים, ועם דיוק די בכך שתוצאות אלה יכולים לשמש לזיהוי תת עמיד לכימותרפיה." אוכלוסיות בניטל הגידול וסופו של דבר, לparameterize מודלים חישוביים נועדו לאמוד תגובה קלינית.
מודלים חישוביים הם כלים רבי עוצמה לניתוח מערכות מורכבות, כגון אינטראקציות סרטן-מארח-טיפול. עם זאת, מודלים הם רק טובים כמו הנתונים המשמשים לparameterize. למרבה הצער, רוב המידע זמין בספרות לא ניתן להשתמש בצורתה הנוכחית לparameterize מודלים כאלה, כפי שהם לעתים קרובות מתקבלים בתנאי ניסוי סותרים. כך, ניסויים חדשים נדרשים לעתים קרובות במטרה להשיג את הסט של פרמטרים ניסיוניים צורך. רוב מבחני הכדאיות, לעומת זאת, הם הרסניים והשלנו מוגבל למספר קטן של נקודות זמן, לעתים קרובות רק אחד. זה מציב מכשול באופן משמעותי את השימוש במבחני chemosensitivity לparameterize מודלים חישוביים, מאז ניסויים כאלה אינם מספקים מידע על הדינמיקה הזמנית של המערכת. זה נכון במיוחד עם תאי סרטן ראשוניים, אשר לעתים קרובות מוגבלים לכמה מיליון לדגימה, ויש תוחלת חיים קצרות לאחר ביופסיה, ובכך להגביל את מספר תנאי ניסוי זמינים. בנוסף, רוב מבחני כדאיות דורשים ההפרדה של הסרטן מהתאים שאינם סרטני (סטרומה) בזמן של כימות, אשר מוסיפה עבודה נוספת לפרוטוקול, נוסף מדאיגה את התאים, ומגביל את מספר הניסויים שניתן לבצע .
לפני 40 שנים, סלמון ומשתפי פעולה 1 מוצעת המפורסם שלהם בassay הקמת המושבה מבחנה להערכת chemosensitivity של תאים סרטניים. למרבה הצער assay זה מצא מעורב הצלחה בשל המספר הקטן של mye מרובהדגימות חולה לומה (MM) שהיו מסוגלים להרכיב מושבות בתנאי שליטה: הערכה היה שתת-קבוצה קטנה בלבד של 0.001% ל -0.1% מתאי MM היתה מסוגל שכפול, שכפי שכונו בתאי גזע מסוג מיאלומה נפוצה 2. זה מוגבל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של assay ומספר התרופות שיכולים להיבדק בפעם אחת, אפילו יותר דגמים אחרונים 3. בעיה זו היא הרבה יותר חשובה עכשיו כאשר סוכני MM (סטנדרטיים או ניסיוניים) הם רבים יותר מאשר לפני ארבעה עשורים.
מגבלה עיקרית של מבחני המוקדמים אלה היא התפוקה שלהם dichotomized: או חולה הוא "רגיש" או "עמיד" לתרופה מסוימת. אין מידע מסופק בדבר מידת הרגישות וההטרוגניות של אוכלוסיית הגידול. לפיכך, חולים עם תת-אוכלוסיות קטנות של תאים עמידים בצמיחה מהירה יסווגו כ" רגיש "לטיפול, אבל היה להרע זמן קצר, ולכן לא בןefit מטיפול. לאור החשיבות של משך התגובה בהישרדות כוללת (OS) של חולי סרטן 4,5, ברור איך מבחני אלה לא היו מסוגלים להעריך כראוי OS באופן עקבי.
כדי לעקוף מגבלות אלה, וכדי להיות מסוגלים לייצר מודלים חישוביים מטופל ספציפי שמעריכים תגובה קלינית אישית לפנל של תרופות, פיתחנו שיטה לרגישות סמים בדיקות לא הרסני של מיאלומה נפוצה שורות תאים (MM) ותאי MM עיקריים בשיקום vivo לשעבר של מייקרו-סביבת מח העצם, כוללים מטריצה וסטרומה 6 תאיים. assay זה, עם זאת, היה ההגבלה להסתמך על שקופית מסוימת מסחרית microfluidic, שממדים ועלות הגביל את מספר הניסויים או תרופות שיכולים להתבצע באחת בפיסת הציוד שניתן.
המערכת שתוארה כאן משתרעת assay המקורי זה לגבוה-throughput פלטפורמת organotypic מנה-תגובה, להקרנה במבחנה של תרופות, המבוססים על אלגוריתם ניתוח תמונה דיגיטלי שאינו הרסני לכמת כדאיות תא. כל טוב ב384 או 1,536 גם צלחות הוא שחזור 3D של מייקרו-סביבת מח העצם, כוללים תאים ראשוניים MM, מטריקס, וגורמי סטרומה וצמיחה המופקת מחולה. מיקרוסקופיה חי וניתוח תמונה דיגיטלי המשמשים לאיתור אירועי מוות של תאים בריכוזי תרופה שונים, המשמשים ליצירת משטחי מנה-תגובה. מהנתונים במבחנה, מודל מתמטי מזהה את הגודל וchemosensitivity של תת-אוכלוסיות בתוך נטל הגידול של המטופל, וניתן להשתמש בו כדי לדמות כיצד הגידול יגיב לתרופה (ים) בתנאים פיסיולוגיים במשטר קליני 6 ( איור 1).
החידושים העיקריים של פלטפורמה זו הם: (א) מספר הקטן של תאי הסרטן הנדרשים (1,000-10,000 לconcent סמיםמנה); (ב) הערכת יעילות תרופה בתנאים פיסיולוגיים (מטריקס, סטרומה, גורמי גדילה המופק ממטופל); (ג) לא רעיל מסמני כדאיות 7 מאז רק הדמיה שדה בהירה משמש, ובכך אין צורך transfect תאים עם הקרינה 8 או 9 פליטת אור; (ד) הדמיה רציפה מספקת אפקט תרופה כפונקציה של ריכוז וחשיפת זמן (פרמקודינמיקה); ו- (ה) השילוב בין במבחנה ומודלים חישוביים אבולוציוני, להעריך את התוצאות קליניות 6 (סילבה et al., בהכנה).
הגורם המרכזי המאפשר את אלגוריתם ניתוח תמונה הדיגיטלי להבחין סרטן מתאי סטרומה הוא הזיקה שונה שלהם לתחתית באר: תאי MM אינם דבקים, ויישארו בהשעיה במטריצה, ואילו תאי סטרומה לדבוק בתחתית גם ואז למתוח.
הפרדה זו מתרחשת למרות שMM וסטרומהמחדש נזרע באותו הזמן, ומתרחש במהלך תהליך O / N של דגירה. הזריעה של הצלחת מסתובב למטה בצנטריפוגה הבאה נוספת מאיצה את התהליך הזה. כתוצאה מכך, תאי MM מופיעים בתמונה כדיסקים בהירים עגולים מוקפים בטבעת כהה, בעוד סטרומה שומרת על פרופיל נמוך וגוון כהה יותר (איור 2). לפיכך, assay במתכונתה הנוכחית הוא מתאים ביותר לתאי סרטן שאינו חסיד, למרות התאמות באלגוריתם יכולות להיעשות לסרטן וסטרומה נפרדים המבוססות על תכונות מורפולוגיות אחרות, כגון גודל וצורה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שני סוגים של מטריקס (קולגן ומטריצת קרום במרתף), כמו גם שני סוגים של שיתוף תרבויות, עם BMSC (תאי גזע mesenchymal מח עצם נגזר) וHUVECs, המייצג את נישות ביניים וperivascular של מח העצם , בהתאמה.
שימוש בצלחת 384 גם, 5 ריכוזים לסמים ושתי חזרות, הצלחנו TESלא עד ליום 31 בסמים שונים עם המדגם של מטופל יחיד. בצלחות 1,536 היטב מספר זה הוא 127. איור 3 מתאר את הפריסה המשמשת כיום לזריעת תאים ידנית, ואילו איור נוסף 1 מייצג את החלוקה האופטימלית באמצעות pipettor רובוטית. בעיצוב מאיור 3, כל צלחת 384 גם יכולה לשאת 3 דגימות חולה עם 7 תרופות שונות, או מדגם אחד חולה נבדקו עם 21 תרופות. כל תרופה מיוצגת על ידי 5 ריכוזים, וכל מצב הוא זורעים בכפילויות. 4 בארות שליטה (אין תרופה הוסיפה) הם זורעים לכל סט של 7 תרופות (למשל, בארות 36-39, 126-129 ו200-203). כדי להבטיח את העוצמה של התרופות המשמשות, שורת תאי מיאלומה האנושית (למשל, H929 או MM1.S) היא גם זרע, ומסומם בכפילויות בריכוז הגבוה ביותר של כל אחד מהתרופות המשמשות (בארות 76-89). הביקורת החיובית קו התא מבטיחה כי יש לי התרופות המשמשות עוצמה מספקת, שכן עקומות תגובת המינון שלהם הן AC הדומהניסויי רוס. שתי בארות הם זורעים עם שורת תאי מיאלומה כשליטה לתנאי הסביבה, במילים אחרות, כדי לזהות בעיות אפשריות בחממת הספסל העליון במהלך ההדמיה (בארות 75 ו -90). הספירה של הבארות כדלקמן דפוס זיגזג כדי לצמצם את המרחק מכוסה על ידי הבמה הממונעת של המיקרוסקופ, אשר מפחיתה את זמן רכישה ומפחיתה בלאי של הציוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
לסיכום, מדובר בשיטת תפוקה חזקה וגבוהה לכמת chemosensitivity של תאי MM ראשוניים ופרמקודינמיקה vivo לשעבר של תרופות בבנייה מחדש של מח העצם. השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם הזריעה הנכונה של הבארות והתמקדות נאותות (ראה איור 2 לתוצאות צפויות): להבטיח שתאי MM וסטרומה הם מ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המדינה בנקהד-קולי צוות מדע גרנט של פלורידה (2BT03), המכון הלאומי לבריאות / מכון לאומי לסרטן (1R21CA164322-01) וצוות מדע גרנט של מופיט מרכז הסרטן. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מתקן Translational Core המחקר בח מרכז Lee Moffitt הסרטן ומכון מחקר, מרכז NCI מיועד מקיף למלחמה בסרטן (P30-CA076292). גישה לתאים ראשוניים התאפשרה באמצעות סה"כ סרטן טיפול הפרוטוקול במרכז סרטן מופיט.
Materials
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1mg/mL Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
Riferimenti
- Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
- Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
- Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
- Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
- Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
- Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
- Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236 (2012).
