Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi
Summary
We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.
Abstract
Bu çalışmada biz, hasta kaynaklı multipl miyelom (MM) hücreler kemosensitiviteyi ve heterojenitesini tahmin etmek ex vivo ilaç duyarlılık testleri ve dijital görüntü analizi birleştiren yeni bir yaklaşım açıklar. Bu yaklaşım, hasta-Taze hücre dışı matrisin (kolajen ya da temel membran matrisi) ve stroma (dahil olmak üzere her kemik iliği mikro bir yeniden oluşan, çok oyuklu plakalara uygulanan mikroakışkan odaları içine, kemik iliği elde primer MM tohum hücreleri oluşur türetilmiş mezenkimal kök hücreleri) veya insandan türetilmiş endotel hücreleri (HUVECler). odaları, farklı ajanlar ve konsantrasyonları ile uyuşturulmuş olan ve bir dijital kamera ile donatılmış bir motorlu mikroskopta, parlak bir alan mikroskobu ile 96 saat süreyle sırayla görüntülenmiş. Dijital görüntü analiz yazılımı varlığı veya zar hareket yokluğu canlı ve ölü hücreleri algılar ve bir fonksiyon o kadar canlılığı değişim eğrileri üretirf ilaç konsantrasyonu ve maruz kalma süresi. Her ilaç, tümör nüfusun duyarlılığında parametrelerini yanı sıra, tümör heterojenite bir ölçüsü olarak, bu alt-popülasyonlarının sayısını belirlemek için bir hesaplama modeli kullanırlar. Bu hasta özel modeller daha sonra tedavi rejimleri taklit ve klinik yanıtı tahmin etmek için kullanılabilir.
Introduction
Bu yöntemin amacı, bu sonuçlar Kemoterapiye alt tespit etmek için kullanılabilir yeterli hassasiyetle, fizyolojik koşullara mümkün olduğunca yakın, ex vivo olarak ajanların bir panele birincil hücreler multipl miyeloma (MM), ilaç duyarlılığını karakterize etmektir tümör yükü ve içinde nüfusları sonuçta, klinik yanıtı tahmin etmek için tasarlanan hesaplama modelleri parameterize için.
Hesaplamalı modelleri, kanser konak-terapi etkileşimleri gibi kompleks sistemler, analiz etmek güçlü araçlardır. Ancak, modeller sadece veri onları parameterize eskisi kadar iyi. Ne yazık ki, literatürde mevcut olan en veriler genellikle birbirini dışlayan deney koşullarında elde edilenler gibi, bu tür modeller parametrelerini elde etmek için, mevcut biçimde kullanılamaz. Böylece, yeni deneyler genellikle gerekli deneysel parametrelerin set elde etmek amacı ile ihtiyaç vardır. Çoğu canlılık deneyleri, ancak, yıkıcı ve inci vardırBize zaman noktalarında az sayıda, genellikle sadece birine sınırlı. Bu büyük ölçüde bu tür deneyler sistemin zamansal dinamikleri hakkında bilgi vermek için başarısız beri kemosensitivite tahlillerin kullanımı, hesaplama modelleri parameterize için yaşlılık ve sakatlık. Bu genellikle, böylece mevcut deneysel koşullar sayısının sınırlandırılması, numune başına birkaç milyona sınırlı ve biyopsi sonra kısa bir ömre sahip olan primer kanser hücrelerinin, özellikle de geçerlidir. Buna ek olarak, çoğu canlılık deneyleri ayrıca hücreleri bozan ve yapılabilir deneyler sayısını sınırlar, protokole ekstra çalışma ekler ölçümü, zamanında olmayan kanser (stroma) hücrelerinden kanser ayrılmasını gerektiren .
40 yıl kadar önce, somon ve ortak 1 tümör hücrelerinin duyarlılığında değerlendirilmesi için in vitro koloni oluşturma deneyi kendi ünlü önerdi. Ne yazık ki bu deney sayesinde çoklu mye az sayıda karışık başarı bulunduKontrol koşulları altında koloniler oluşturabilen edildi Loma (MM) hasta numuneleri: Bu, AA hücrelerin 0.1 ila% 0.001,% sadece küçük bir alt-grup replikasyon kabiliyetine sahip olduğu tahmin edilmiştir multipl miyelom kök hücreler 2 olarak adlandırılan edilir. Bu anlamlı daha yeni modeller 3, testin başarı oranını ve bir anda test edilebilir ilaçların sınırlı sayıda. (Standart ya da deneysel) MM ajanlar, dört yıl önce daha çoktur Bu sorun artık çok daha önemlidir.
Ya bir hasta belirli bir ilaca "hassas" veya "dirençli" dir: Bu erken tahlillerin önemli bir sınırlama onların ikiye bölünmüş çıkışıdır. Hiçbir bilgi tümör nüfusun duyarlılık ve heterojen derecesine ilişkin sağlanmaktadır. Böylece, hızlı büyüyen dirençli hücrelerin küçük alt popülasyonlar olan hastalar tedaviye "hassas" olarak sınıflandırılır, ancak kısa bir süre nüks olur ve böylece değil bentedaviden Efit. Kanser hastalarının 4,5 genel sağkalım (OS) yanıt süresi önemi göz önüne alındığında, bu deneyler doğru sürekli OS tahmin etmek mümkün değildi nasıl açıktır.
Amacıyla bu sınırlamaları aşmak için, ve uyuşturucu bir panele kişiselleştirilmiş klinik yanıtı tahmin ediyorum hastaya özgü hesaplama modelleri üretmek edebilmek için, biz multipl miyelom (MM) hücre hatlarının olmayan yıkıcı test ilaç duyarlılığı için bir yöntem geliştirdik ve hücre dışı matriks ve stroma 6 olmak üzere kemik iliği mikroçevresindeki bir ex vivo yeniden, birincil MM hücreleri. Bu deney, ancak, kimin boyutları ve maliyetli ekipman belirli bir parça bir defada yapılabilecek deneyler veya ilaç sayısını sınırlı belirli bir ticari mikroakışkan slayt, güvenerek sınırlama vardı.
Burada anlatılan sistem, yüksek içine bu orijinal tahlil uzanırolmayan yıkıcı hücre canlılığını ölçmek için bir dijital görüntü analizi algoritmasına dayalı ilaçlar, in vitro tarama için Organotipik doz-yanıt platformu, -throughput. De 384 ya da 1536 oyuklu plakalarda her primer MM hücreleri, hücre-dışı matris ve hasta türevi stroma ve büyüme faktörleri de dahil olmak üzere kemik iliği mikro-3D rekonstrüksiyonu vardır. Canlı mikroskopi ve dijital görüntü analizi doz-yanıt yüzeyler üretmek için kullanılan farklı ilaç konsantrasyonları, hücre ölümü olayları tespit etmek için kullanılır. In vitro verilerden, bir matematiksel model hastanın tümör yükü içinde boyutu ve alt-popülasyonlarının kemosensitiviteyi tanımlar ve tümörü (klinik rejime 6 fizyolojik koşullarda ilaç (lar) nasıl tepki vereceğini simüle etmek için kullanılabilir Şekil 1).
Bu platformun temel yenilikler şunlardır: İlaç konsantrasyonlarda başına gereken kanser hücrelerinin, (a), az sayıda (1,000-10,000rasyon); (B) anılan ilacı, fizyolojik koşullar etkinlik (hücre dışı matrisin, stroma hasta türevli büyüme faktörleri) değerlendirilmesi; (C) Sadece parlak bir alan görüntüleme beri canlılık belirteçleri 7 No toksisite, floresan 8 veya 9 biyoparlaklık ile hücreleri transfect böylece hiç gerek kullanılır; (D) Sürekli görüntüleme konsantrasyonu ve uygulama zamanı (farmakodinamik) 'in bir fonksiyonu olarak, ilaç etki sağlar; ve (e) in vitro ve hesaplamalı evrimsel modeller arasındaki entegrasyon, klinik sonucu 6 (Silva ve ark., hazırlık) tahmin etmek.
Dijital görüntü analizi algoritması stromal hücrelerin kanser ayırt sağlar önemli bir faktördür altına onların farklı afinite de: dd hücreleri uygun ve stromal hücreler alt uygun ise, matris içinde süspansiyon halinde kalır yok iyi ve daha sonra streç.
Bu ayrılık bile MM ve stroma a da oluşurAynı zamanda tohumlanmıştır ve inkübasyon O / N işlemi sırasında oluşur yeniden. plaka santrifüj aşağı iplik aşağıdaki tohumlama daha bu süreci hızlandırır. Stroma düşük bir profil ve koyu gölge (Şekil 2) korurken Sonuç olarak, MM hücreleri, karanlık bir halka ile çevrili yuvarlak parlak diskler gibi görüntüde görünür. Algoritması ayarlamaları gibi boyut ve şekil olarak diğer morfolojik özellikleri, dayalı ayrı kanser ve stroma ile yapılabilir rağmen Böylece, mevcut haliyle tahlil, yapışmayan kanser hücreleri için uygundur. Bu protokolde, (kemik iliğinden elde edilen mezenkimal stem hücreleri) BHYK ve HUVECler, kemik iliği interstisyel ve perivasküler niş temsil eden, hücre-dışı matrisi (kollajen ve temel zar matris) iki tip olarak ko-kültürler iki tip tarif sırasıyla.
384-plaka kullanarak, ilaç başına 5 konsantrasyonları ve iki çoğaltır, biz tes başardıkTek bir hastanın numune ile 31 farklı ilaçlara t kadar. Ek Şekil 1 bir robot pipet kullanarak optimum dağılımını temsil ederken 1,536 kuyucuğu bu sayı, 3 şu anda manuel hücre tohumlama için kullanılan düzen göstermektedir 127. Şekil olduğunu. Şekil 3'ten tasarımda, her bir 384-oyuklu plaka 21 ilaç test 7 farklı ilaçlar, ya da bir hasta örneği 3 hasta numuneleri taşıyabilir. Her ilaç 5 konsantrasyonları ile temsil edilir, ve her bir durum çiftleri olarak tohumlanır. 4 kontrol kuyuları (ilaç yok) eklendi 7 ilaçlar (örneğin, kuyular 36-39, 126-129 ve 200-203) her biri için tohumlanır. Kullanılan ilaçların etkisini temin etmek için, insan miyeloma hücre kuşağı (örneğin, H929 ya da MM1.S), aynı zamanda tohumlandı ve (kuyular 76-89) kullanılan ilaçların her birinin en yüksek konsantrasyonda iki kopya halinde uyuşturulmuş. pozitif hücre hattı kontrolü onların doz yanıt eğrileri karşılaştırılabilir ac beri kullanılan ilaçlar, yeterli güce sahip olmalarını sağlarross deneyleri. Iki kuyu (kuyular 75 ve 90), görüntüleme sırasında tezgah üstü inkübatör olası sorunları tespit etmek için, başka bir deyişle, çevre koşulları için bir kontrol olarak, bir miyeloma hücre kuşağı ile tohumlanır. Kuyuların numaralandırma etme süresini azaltır ve ekipmanın aşınmasını azaltan mikroskop motorlu aşamasında tarafından katedilen mesafeyi azaltmak için zikzak bir yol izler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Özet olarak, bu kemik iliği, bir yeniden birincil MM hücre ve ilaç ex vivo farmakodinamik kemosensitiviteyi ölçmek için güçlü ve yüksek kapasiteli bir yöntemdir. Bu protokol kapsamında kritik adımlar kuyuların uygun tohumlama ve yeterli (beklenen sonuçlar için bakınız Şekil 2) odaklama: MM ve stromal hücreler düzgün yayılı sağlamak, bu stromal hücreler, kuyunun dibine yapışık olan MM tüm Hücreler, MM hücreleri koyu halka çevrili aydınlık diskin yönü olan ay…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Florida'nın Bankhead-Coley Takımı Bilim Grant (2BT03), Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü (1R21CA164322-01) ve Moffitt Kanser Merkezi'nin Takım Bilim Grant National Institutes Devlet tarafından finanse edildi. Bu eser, H. Lee Moffitt Kanser Merkezi ve Araştırma Enstitüsü, bir NCI belirlenen Kapsamlı Kanser Merkezi'nde (P30-CA076292) de çeviriyle ilgili araştırma Çekirdek Tesisi tarafından kısmen desteklenmiştir. Birincil hücrelere Erişim Moffitt Kanser Merkezi'nde Toplam Cancer Care Protokolü'nün sayesinde mümkün olmuştur.
Materials
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1mg/mL Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
Riferimenti
- Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
- Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
- Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
- Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
- Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
- Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
- Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236 (2012).
